李俊峰， 舒建昌， 陳蓮香， 朱海燕， 呂 霞

(1 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，廣東 廣州510630;2 暨南大學(xué)附屬第四醫(yī)院 消化科，廣東 廣州510175)

肝纖維化是肝損傷-修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積的病理過(guò)程。肝細(xì)胞損傷和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化是這一過(guò)程的中心環(huán)節(jié)［1］。改善肝細(xì)胞損傷、抑制肝細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)活化的HSCs 凋亡，可逆轉(zhuǎn)肝纖維化［2-4］。神 經(jīng) 生 長(zhǎng) 因 子(nerve growth factor，NGF)/p75NTR神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)肽途徑調(diào)控肝星狀細(xì)胞分化、增殖和凋亡，參與肝損傷-修復(fù)過(guò)程［5-7］。但是NGF 對(duì)肝細(xì)胞作用研究較少，本研究旨在探討外源性重組人NGF-β 對(duì)肝細(xì)胞的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞株L02 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 試劑及抗體 DMEM 培養(yǎng)基、0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、重組人NGF -β(R＆D)，兔抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體(rabbit anti-nerve growth factor，anti-NGF)、兔抗神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體p75抗體(rabbit anti - neurotrophin receptor p75，anti -p75NTR)、兔抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA 抗體(rabbit anti-tyrosine kinases receptor A，anti-TrkANGFR)(武漢博士德公司)，3，3'-［1 -(苯氨?；?-3，4 -四氮唑］-二(4 -甲氧基-6 -硝基)苯磺酸鈉{2，3 -bis(2 -methoxy - 4 -nitro - 5 -sulfophenyl)-5 -［(phenylamino)carbonyl］-2H -tetrazolium hydroxide，XTT}(BBI)，吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)(Sigma)，Annexin V - FITC/propidium iodide(PI)凋亡試劑盒(南京凱基公司)，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB 顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，Trizol、Taq DNA polymerase(Invitrogen)，SYBR PrimeScript PCR 試劑盒(TaKaRa)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02 細(xì)胞株接種在加有1 ×105U/L青霉素、100 mg/L 鏈霉素、10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)倒置顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液，注意監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的pH 值，在細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80% ～90%時(shí)，0.25%含EDTA 胰蛋白酶消化傳代，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)L02 細(xì)胞NGF、TrkANGFR和p75NTR蛋白的表達(dá) 每孔接種細(xì)胞1 ×105于6 孔板內(nèi)的蓋玻片上，孵育24 h 后，棄培養(yǎng)液，分別加入濃度為100 μg/L NGF-β 的培養(yǎng)液1 mL，同時(shí)設(shè)立不加試劑為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS 沖洗3 次，每次3 min。加入2 mL 冷丙酮固定10 min，PBS沖洗細(xì)胞爬片3 min，重復(fù)3 次。3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS 沖洗3 min，重復(fù)3 次，每張爬片滴加正常非免疫動(dòng)物血清封閉非特異性抗原，濕盒內(nèi)室溫孵育10 min，滴加兔抗人多克隆抗體(anti - NGF、anti - TrkANGFR和anti -p75NTR)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 沖洗3 次，每次3 min，滴加即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育10 ～15 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min。DAB 顯色試劑顯色，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡觀察并拍片，以胞膜或胞漿棕色顆粒表達(dá)為陽(yáng)性。

隨機(jī)選取細(xì)胞爬片中的不同部位5 個(gè)高倍鏡視野(×200)，顯微鏡下通過(guò)AxioVision 圖像采集系統(tǒng)在同等條件下采集圖片。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的平均吸光度值(average absorbance，AA)。每個(gè)視野陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的AA 等于視野陽(yáng)性表達(dá)的積分吸光度值(integral absorbance，IA)/視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)。

2.3 熒光定量PCR 檢測(cè)NGF、TrkANGFR和p75NTRmRNA 表達(dá) 每瓶接種細(xì)胞1 ×106于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h 后，棄上清，分別加入含NGF - β(100 μg/L)的培養(yǎng)液4 mL，以不加試劑組為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集所有細(xì)胞。Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，采用Oligo (dT)引物和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR。NGF 上游引物5' - GACTCACAGGAGCAAGCGGT -3'，下游引物5'-CTGTGGCGGTGGTCTTATCC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度 107 bp; p75NTR上 游 引 物 5' -CTCGCGATTTCAAACCTGGA -3'，下游引物5'-TTGTGGGTGGCTTTACAGCTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度108 bp;TrkANGFR上 游 引 物 5' - ACCCTCTGTACCCCCGATCT - 3'，下游引物5' - TCGATGTAGCTTGCTGCCAA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度102 bp;內(nèi)參照β -actin 上游引物5'-GCGCGGCTACAGCTTCA -3'，下游引物5' - TCTCCTTAATGTCACGCACGAT -3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度59 bp。PCR 反應(yīng)條件:93 ℃3 min，93℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，循環(huán)40 次，重復(fù)3 次。

2.4 XTT 法檢測(cè)NGF-β 對(duì)L02 細(xì)胞增殖的影響

調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔5×103接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后，棄去上清，分別加入含不同濃度梯度(12.5、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/L)的NGF-β 培養(yǎng)液100 μL，設(shè)不加NGF -β 對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入50 μL XTT 比色液，避光孵育4 h，在主波長(zhǎng)為490 nm、參考波長(zhǎng)為630 nm 的連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度(A 值)。

2.5 XTT 法檢測(cè)anti-NGF、anti-TrkANGFR和antip75NTR對(duì)NGF-β 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞增殖的影響 接種細(xì)胞5 ×103于96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，棄去上清，加入NGF(100 μg/L)孵育15 min 后，分別加入anti-NGF、anti-TrkANGFR和anti -p75NTR培養(yǎng)液(濃度為100 μg/L)，設(shè)不加藥組為陰性對(duì)照，只加NGF - β 為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μL XTT 比色液，避光孵育4 h，在主波長(zhǎng)為490 nm、參考波長(zhǎng)為630 nm 的連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度(A 值)。

2.6 流式細(xì)胞儀(Annexin V - FITC/PI 法)檢測(cè)NGF-β 對(duì)L02 細(xì)胞凋亡的影響 每孔接種1 ×106于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，棄上清，分別加入不同濃度梯度(25、50、100、200、400 μg/L)的NGF - β 培養(yǎng)液，設(shè)不加NGF -β 組為對(duì)照，繼續(xù)孵育24 h，收集所有細(xì)胞，1 000 r/min 離心棄上清，加入200 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 和PI 各2 μL，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀(BD FACSAria)檢測(cè)L02 細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3 次。

2.7 流式細(xì)胞儀(PI 法)檢測(cè)NGF -β 對(duì)L02 細(xì)胞周期的影響 每孔接種細(xì)胞1 ×106，于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，分別加入不同濃度梯度(0、12.5、25、50、100、200 μg/L)的NGF -β，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h 后，收集所有細(xì)胞，70%冷乙醇4 ℃固定，離心棄乙醇，加入200 μL PI 染液，混勻，過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 L02 細(xì)胞NGF、TrkANGFR 和p75NTR 蛋白及mRNA 表達(dá)

L02 細(xì)胞表達(dá)NGF、TrkANGFR、p75NTR蛋白，外源性NGF-β 處理24 h 后的L02 細(xì)胞與未加藥組比較，細(xì)胞胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上出現(xiàn)較多的棕色顆粒，NGF 陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值(0.3880 ±0.0270 vs 0.2595 ±0.0241，P ＜0.05)和TrkANGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值(0.3849 ±0.0194 vs 0.3110 ±0.0254，P ＜0.05)明顯增大，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;p75NTR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度值(0.2887 ±0.0759 vs 0.2524 ±0.0378，P ＞0.05)略有增大，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

Figure 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR protein expression in L02 cells(immunocytochemistry，×200).A，C，E:control;B，D，F(xiàn):TGFβ.A，B:NGF;C，D:TrkANGFR;E，F(xiàn):p75NTR.圖1 NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞NGF、TrkANGFR和p75NTR蛋白表達(dá)的影響

L02 細(xì)胞表達(dá)NGF、p75NTR和TrkANGFRmRNA，外源性NGF - β 上調(diào)了L02 細(xì)胞表達(dá)NGF mRNA(0.3550 ±0.2140 vs 0.2140 ±0.0135，P ＜0.01)和TrkANGFRmRNA (0.1586 ± 0.0289 vs 0.0644 ±0.0084，P ＜0.01)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;p75NTRmRNA (0.0130 ± 0.0034 vs 0.0063 ±0.0005，P ＞0.05)的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 熒光定量RT－PCR 檢測(cè)NGF、TrkANGFR 和p75NTR mRNA 的表達(dá)Table 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR mRNA expression in L02 cells detected by fluorescent quantitative PCR (±s.n=3)

表1 熒光定量RT－PCR 檢測(cè)NGF、TrkANGFR 和p75NTR mRNA 的表達(dá)Table 1. NGF，TrkANGFR and p75NTR mRNA expression in L02 cells detected by fluorescent quantitative PCR (±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control.

Group NGF TrkANGFR p75 NTR±0.0005 NGF 0.3550±0.0070＊＊0.1586±0.0289＊＊Control 0.2140±0.0135 0.0644±0.0084 0.0063 0.0130±0.0034

2 外源性NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞增殖的作用

外源性NGF -β 促進(jìn)L02 細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性，表現(xiàn)為倒立U 形曲線。25 ～200 μg/L 濃度范圍內(nèi)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，25 μg/L 時(shí)增殖作用最強(qiáng);400 ～1 600 μg/L 濃度范圍內(nèi)對(duì)L02 細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Effect of NGF-β on L02 cell proliferation at different concentrations (XTT assay). ±s. n =4. * P ＜0.05 vs control(0 μg/L).圖2 XTT 比色法檢測(cè)不同濃度NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞增殖的作用

3 Anti－NGF、anti－TrkANGFR 和anti－p75NTR 對(duì)NGF－β 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞增殖的作用

Anti-NGF 和anti-TrkANGFR抑制NGF -β 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);anti-p75NTR不影響NGF-β 誘導(dǎo)的L02細(xì)胞增殖，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effects of anti - NGF，anti - TrkANGFR and anti -p75NTR on NGF - β induced L02 cell proliferation(XTT assay). ±s. n =4. * P ＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs NGF-β.圖3 Anti－NGF、anti－TrkANGFR和anti－p75NTR對(duì)NGFβ 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞增殖的影響

4 NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞凋亡的影響

外源性NGF -β 對(duì)L02 細(xì)胞有抗凋亡趨勢(shì)，濃度50 μg/L 抗細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)(1.2 ±0.2 vs 1.9±0.7)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見(jiàn)圖4。

5 NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞周期的影響

NGF-β 作用于L02 細(xì)胞周期的S 期，呈劑量依賴性，濃度為25 μg/L 作用最強(qiáng)(25.60% ±0.32%vs 21.10% ±0.30%)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，200 μg/L 抑制L02 細(xì)胞分化(18.40% ±0.40% vs 21.10% ±0.30%)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見(jiàn)圖5。

討 論

NGF 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中重要的成員，是神經(jīng)細(xì)胞及非神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和生存的重要因子。NGF 結(jié)合高親和受體TrkANGFR激活細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen - activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)級(jí)聯(lián)引起細(xì)胞分化和存活。NGF 結(jié)合低親和受體p75NTR，依賴募集到p75NTR細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的因子不同，促進(jìn)細(xì)胞生存、分化或凋亡［8］。肝細(xì)胞增殖時(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophins，NTs)mRNA 和蛋白水平表達(dá)明顯增高，NTs 可能對(duì)肝細(xì)胞增殖起重要作用［9-10］，Gigliozzi 等［11］研究發(fā)現(xiàn)外源性NGF 刺激膽管上皮細(xì)胞增殖。

Figure 4. The effect of NGF-β on apoptosis of L02 cells at different concentrations (flow cytometry assay). A:control (0 μg/L)B:25 μg/L;C:50 μg/L;D:100 μg/L;E:200 μg/L;F:400 μg/L. xˉ±s.n=3.圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞凋亡的作用

本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)及熒光定量PCR 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)增殖的肝細(xì)胞表達(dá)NGF 和TrkANGFR，弱表達(dá)p75NTR;外源性NGF -β 促進(jìn)L02 細(xì)胞表達(dá)NGF 和TrkANGFR，與以前學(xué)者提出正?；驌p傷的肝細(xì)胞不表達(dá)TrkANGFR相矛盾，可能與細(xì)胞處在不同周期有關(guān)［10，12-13］。NGF 主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，TrkANGFR和p75NTR主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。外源性NGF-β 對(duì)肝細(xì)胞的作用呈雙峰模式，調(diào)控細(xì)胞周期的S 期，低劑量(25 ～200 μg/L)促進(jìn)L02 細(xì)胞增殖，抗肝細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性，與不加NGF-β 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，25 μg/L 增殖作用最強(qiáng)，高劑量(400 ～1 600 μg/L)抑制L02 細(xì)胞增殖;增殖曲線呈倒立的U 字形，與Kemp 等［14］研究認(rèn)為低劑量NGF 促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，高劑量抑制軸突生長(zhǎng)一致，可能機(jī)制是NGF 的生物學(xué)效應(yīng)與膜受體相對(duì)比值有關(guān)，NGF 低濃度時(shí)先結(jié)合TrkANGFR受體，高濃度時(shí)TrkANGFR受體飽和，增加了NGF與p75NTR結(jié)合，從而抑制細(xì)胞增殖。中和抗體anti -NGF 抑制外源性NGF -β 誘導(dǎo)的L02 細(xì)胞增殖，可能原因是anti-NGF 中和了L02 細(xì)胞自身分泌的和外源性NGF;中和抗體anti - TrkANGFR阻礙NGF 與TrkANGFR結(jié)合，從而抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，抑制肝細(xì)胞的增殖;中和抗體anti -p75NTR與p75NTR細(xì)胞外域結(jié)合，阻止NGF 與p75NTR結(jié)合，抑制NGF/p75NTR信號(hào)途徑，細(xì)胞凋亡減少;因此NGF 可能通過(guò)NGF/TrkANGFR信號(hào)通路，調(diào)控L02 細(xì)胞的增殖和分化。外源性NGF-β 能夠上調(diào)L02 細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性NGF，可能是啟動(dòng)了內(nèi)分泌的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，與促進(jìn)L02 細(xì)胞增殖有關(guān)，增殖的L02 細(xì)胞分泌更多的NGF，確切機(jī)制需進(jìn)一步研究。

Figure 5. Effect of NGF-β on cell cycle of L-02 cells (flow cytometry assay). A:control (0 μg/L);B:12.5 μg/L;C:25 μg/L;D:50 μg/L;E:100 μg/L;F:200 μg/L. xˉ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖5 NGF－β 對(duì)L02 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

本研究發(fā)現(xiàn)增殖的L02 細(xì)胞分泌NGF，表達(dá)受體TrkANGFR和p75NTR;外源性NGF -β 上調(diào)NGF 和TrkANGFR蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞分化、增殖，為預(yù)防和治療肝纖維化提供新的靶點(diǎn)。

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