中華獼猴桃根三萜類化合物雙水相超聲提取工藝及抗癌活性分析

趙紅巖

中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.），又名藤梨、羊桃藤等，是中國特有的藤本果種，因其渾身布滿細小絨毛，很象桃，而獼猴喜食，故有其名（李時珍《本草綱目》）。中華獼猴桃根又稱藤梨根。藤梨根性寒、味苦，可清熱解毒、活血消腫、祛風利濕，常用于風濕性關節(jié)炎、跌打損傷、絲蟲病、肝炎、痢疾、淋巴結結核、癰癤腫毒、癌癥等?，F(xiàn)代研究表明，其根中含三萜類、黃酮類、蒽醌類、酚類及其他多種活性成分，其中以三萜類成分為主[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃根具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理作用[3-5]。

目前，國內對于植物中三萜類成分提取的方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2提取法、超聲波提取法、雙水相提取法等。溶劑提取法主要是利用有機溶劑對原料中的三萜成分回流提取，此提取方法簡單方便、生產(chǎn)的一次性投入較低，但此過程中成分損失較大、周期長且提取效率較低。超臨界CO2提取技術具有高效、安全、幾乎無毒等特點，但其設備的一次性投入較大、生產(chǎn)技術工藝不夠完善。超聲波提取技術是利用超聲波產(chǎn)生空穴效應增強細胞膜的通透性，將原料中的三萜成分提取到溶劑中，具有提取效率高、提取時間短、節(jié)能等優(yōu)點，目前廣泛應用于藥物活性成分的提取領域。雙水相萃取技術是利用物質在雙水相體系中的選擇性分配進行分離，此提取工藝具有設備簡單、操作條件溫和、高效安全等特點。試驗采用雙水相提取和超聲波提取相結合的方法，采用正交試驗法考查提取中性鹽的質量濃度、有機溶劑體積分數(shù)、超聲時間和料液比4個因素對中華獼猴桃根中三萜類化合物提取率的影響。同時，考查了三萜類提取物對3種腫瘤細胞的抑制活性。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸標準品（純度99.5%），中國藥品生物檢定所提供；香草醛、冰醋酸、異丙醇、硫酸銨、高氯酸，西安化學試劑廠提供；噻唑藍（MTT）、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM培養(yǎng)基，北京西美杰科技有限公司提供；人胃癌細胞株（SGC7901）、人肝癌細胞株（Bel-7402）、人結腸細胞株（SW620），中國醫(yī)學科學研究院腫瘤細胞庫提供。

UV1901型紫外-可見分光光度計，上海奧析科學儀器有限公司產(chǎn)品；HBS-1096A型酶聯(lián)免疫檢測儀，南京德鐵實驗設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 三萜類化合物提取工藝條件的確定

取干燥的中華獼猴桃根粉碎，過40目篩，置于提取器中，以不同的硫酸銨質量濃度（A）、異丙醇體積分數(shù)（B）、不同的超聲時間（C） 和料液比（D）為參數(shù)，考查其對三萜類化合物提取率的影響。以香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測定三萜類化合物的含量[6]。按下述公式計算三萜類化合物的提取率。

式中：C——三萜類物質的質量濃度，mg/mL；

V——提取液的定容體積，mL；

M——樣品質量，mg。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.2.2 MTT法評價各種衍生物的抗腫瘤活性

采用MTT法測試所合成的衍生物對人胃癌細胞株（SGC-7901）、人肝癌細胞株（Bel-7402） 和人結腸癌細胞株SW620的體外生長增殖抑制活性。

試驗步驟如下：①收集對數(shù)期生長狀態(tài)良好的癌細胞，加入20%的胰蛋白酶消化液，制成細胞懸液，并將細胞密度控制在5×104個/mL。②取細胞懸液接種于96孔板上，200 μL/孔，采用DMEM培養(yǎng)基（加入10%胎小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37℃條件下培養(yǎng)24 h。③換液，按預設的質量濃度梯度（最大為100 mg/mL） 加入待測樣品,每孔50 μL，每個質量濃度梯度下設計5個平行孔，同時以等量的DMSO進行空白對照試驗；置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37℃條件下培養(yǎng)48 h。④離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS緩沖液沖洗3遍后，再加入含MTT（5 mg/mL）的培養(yǎng)液，然后在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育4 h。⑤吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長493 nm處測量各孔的吸光度（OD值）。得到的結果采用下列代入式計算各物質對腫瘤細胞生長的抑制率。

以抑制率為縱坐標、以衍生物的質量濃度為橫坐標作圖，求出每個衍生物的IC50值。

2 結果與分析

2.1 正交試驗

正交試驗結果分析見表2。

表2 正交試驗結果分析

由表2可知，影響中華獼猴桃根中三萜類物質提取率因素的主次順序為超聲時間＞料液比＞硫酸銨質量濃度＞異丙醇體積分數(shù)。正交試驗的最佳組合為A3B1C1D2，即硫酸銨質量濃度0.18 g/mL，異丙醇體積分數(shù)40%，超聲時間30 min，料液比1∶9。

2.2 驗證試驗

因確定的提取三萜類物質最佳工藝條件不在正交試驗的9個組合中，為了考查最優(yōu)條件的重現(xiàn)性進行驗證試驗。采用最佳提取工藝條件A3B1C1D2，重復5次試驗過程，計算得出中華獼猴桃根三萜類物質的提取率為6.78%±0.03%。試驗結果表明，在上述條件下三萜類物質的提取率相對穩(wěn)定，能達到優(yōu)化的目的。

2.3 衍生物的抗腫瘤評價與分析

采用MTT法測定三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制活性，計算抑制率。

三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制率見表3。

表3 三萜類化合物對3種腫瘤細胞的抑制率

由表3可知，中華獼猴桃根中的三萜類化合物對胃癌細胞株、肝癌細胞株、結腸癌細胞株均有一定的抑制活性。其中，對胃癌細胞株抑制活性最為突出，抑制率為38.1%，當三萜類化合物質量濃度為80 mg/mL時，抑制率既已超過50%，且抑制率隨物質質量濃度增加而增加。

3 結論

三萜類化合物是中華獼猴桃根中主要活性物質。試驗中采用硫酸銨和異丙醇組成的雙水相系統(tǒng)，并結合超聲波提取確定最佳提取工藝條件為硫酸銨質量濃度0.18 g/mL，異丙醇體積分數(shù)40%，超聲時間30 min，料液比1∶9。雙水相提取與超聲波提取相結合提取三萜類物質的工藝過程與傳統(tǒng)的提取技術相比，工藝條件更為溫和，三萜類物質更易于分離。將提取得到的三萜類化合物采用MTT法分析其抗腫瘤活性。結果表明，中華獼猴桃根中的三萜類物質對所選的3種腫瘤細胞均有一定的抑制活性，尤其是對胃癌細胞的抑制活性最為顯著。