中國荷斯坦奶牛ITGB2基因多態(tài)性及其與乳房炎抗性和產(chǎn)奶性狀的相關(guān)分析

楊宇澤，馮 濤， 路永強(qiáng)，郭江鵬，常 卓，趙春穎，程京媛

（1. 北京市畜牧總站，北京 100107；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

整合素β-2（Integrin Subunit Beta 2，ITGB2）基因，又稱CD18基因，定位于牛1號染色體。ITGB2基因D128G突變可引起牛常染色體隱形遺傳疾病——牛白細(xì)胞粘附綜合征（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD），是近年來的研究熱點(diǎn)[1]。ITGB2基因主要在白細(xì)胞表達(dá)，相對于非反芻動物，在反芻動物間保守性更高[2]。白細(xì)胞粘附缺陷（Leukocyte Adhesion Deficiency，LAD）主要表現(xiàn)為典型的白細(xì)胞粘附功能異常[3]，已在牛[1,4-5]、水牛[6]、狗[4,7-8]和人類[9-10]中發(fā)現(xiàn)該疾病，大部分LAD是由于ITGB2基因D128G突變引起，但也有由ITGB2基因其他突變引起的[4,7,9]。牛ITGB2基因表現(xiàn)出高度多態(tài)，除D128G外的其他突變是否與牛體細(xì)胞評分（Somatic Cell Score，SCS）和產(chǎn)奶性狀（305 d產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳蛋白和乳脂）有關(guān)目前還沒有相關(guān)報(bào)道。

前期本團(tuán)隊(duì)在中國荷斯坦奶牛群體中高體細(xì)胞數(shù)（High Somatic Cell Count，SCC）母牛（SCC＞250×105/mL，n=25）與低SCC母牛（SCC＜5×105/mL，n=25）ITGB2基因序列比對研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP位點(diǎn)（389C＞T[rs108953545]和774C＞T[rs209411752]）（楊宇澤等，未發(fā)表），這兩個(gè)SNP位點(diǎn)與中國荷斯坦奶牛乳房炎抗性及產(chǎn)奶性狀是否有關(guān)值得進(jìn)一步研究。因此，本文研究牛ITGB2基因2個(gè)突變位點(diǎn)389C＞T和774C＞T在中國荷斯坦奶牛群體中的多態(tài)性，并分析其與SCS和產(chǎn)奶性狀的關(guān)系，以期找到與以上性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為提高奶牛乳房炎抗性和產(chǎn)奶性狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳房炎評分和產(chǎn)奶性狀數(shù)據(jù)收集 1 212頭中國荷斯坦奶牛第1胎SCS和5個(gè)產(chǎn)奶性狀（305 d產(chǎn)奶量、乳脂和乳脂率、乳蛋白和乳蛋白率）數(shù)據(jù)來自于北京市畜牧總站的DHI（Dairy Herd Improvement）數(shù)據(jù)庫。

1.2 基因型分析 2016年通過尾靜脈采集北京市郊區(qū)2個(gè)牛場共1 212頭中國荷斯坦奶牛血樣，利用DNA提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit，北京）提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測和NanoDrop 1000測定DNA濃度后保存待用。

奶牛個(gè)體DNA樣品SNP位點(diǎn)基因型測定使用ABI PRISM SNaPshot（Applied Biosystems，CA，USA）方法進(jìn)行。首先用普通PCR體系分別擴(kuò)增包含389和774位點(diǎn)在內(nèi)的片段，389位點(diǎn)擴(kuò)增（產(chǎn)物長度389 bp）引物為F：5'-GAATCTGAATAGGCGTCCTGC-3'和R：5'-GGAGTAGGAGAGGTCCATCAGG-3'，774位點(diǎn)擴(kuò)增（產(chǎn)物長度376 bp）引物為F：5'-ACTGGGCATGGAG GATGCAG-3'和R：5'-CGCAAAGTGGAACCCATCG T-3'，PCR產(chǎn)物純化后待用。SNaPshot的10 μL反應(yīng)體系中包括 SNaPshot Multiplex 試劑5 μL、混合引物2 μL（389位點(diǎn)引物389F：5'-ttttttttttttttttttttttAGGTCAGGC AGTTGCGTTCAA-3'和774位點(diǎn)引物774R：5'-tttttttt ttttttttttttttttttttttATCGTCCGTGGCGAACACCA-3'）、PCR純化產(chǎn)物混合模板2 μL、用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為95℃變性5 min、10個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s、62℃降至 53℃ 30 s、72℃ 30 s， 接 30個(gè) 循 環(huán)：95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，72℃ 10 min。擴(kuò)展產(chǎn)物經(jīng)純化后加1單位蝦堿性磷酸酶（SAP）37℃孵育60 min，之后85℃ 15 min使酶滅活。純化后的產(chǎn)物1 μL、Gene Scan-120 LIZ 標(biāo) 品 0.5 μL（Applied Biosystems）和 HI-DI 8.5 μL混 合 后 ABI 3730測 序 儀（Applied Biosystems）上樣。最終，測序結(jié)果用GeneMapper 4.0軟件（Applied Biosystems）分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 1 212頭中國荷斯坦奶牛是隨機(jī)選擇6個(gè)公牛的后代（206、199、196、191、208、212頭個(gè)體），近年來沒有對SCS及其他乳房炎抗性性狀以及產(chǎn)奶性狀進(jìn)行過選擇。奶牛分娩季節(jié)按每3個(gè)月分為4個(gè)季節(jié)：春季（3—5月，295頭）、夏季（6—8月，314頭）、秋季（9—11月，283頭）、冬季（12—2月，320頭）。

收集1 212頭奶牛對應(yīng)的公牛編號、牛場、產(chǎn)犢季節(jié)、SCS和5個(gè)產(chǎn)奶性狀數(shù)據(jù)，利用以下統(tǒng)計(jì)模型對ITGB2基因不同基因型個(gè)體的SCS和產(chǎn)奶性狀進(jìn)行最小二乘方差分析[11-12]：

其中，yijklm表示基因型對應(yīng)的測定值，μ代表群體均數(shù)，Bi代表第i頭公牛的固定效應(yīng)（i=1，2，3，4，5，6），Hj代表第j個(gè)牛場的固定效應(yīng)（j=1，2），CSk代表第k個(gè)產(chǎn)犢季節(jié)的固定效應(yīng)（k=1，2， 3，4），Gl代表第l種基因型的固定效應(yīng)（l=1，2，3或1，2，3，4，5，6），eijklm為隨機(jī)殘差效應(yīng)。利用SAS9.2軟件Proc GLM（General Linear Model）過程完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 389和774位點(diǎn)基因型及等位基因頻率 在中國荷斯坦奶牛群體中檢測到了ITGB2基因389和774位點(diǎn)多態(tài)性。如表1所示，C等位基因是2個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因，CT和CC基因型分別是389和774位點(diǎn)的優(yōu)勢基因型?？ǚ綑z驗(yàn)顯示中國荷斯坦奶牛研究群體在2個(gè)SNP位點(diǎn)上均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。

2.2 SNP效應(yīng)與相關(guān)性分析 中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的效應(yīng)如表2所示，774位點(diǎn)與乳蛋白率顯著相關(guān)（P＜0.05），與其他5個(gè)性狀無顯著相關(guān)（P＞0.05），其中CC基因型個(gè)體乳蛋白率顯著高于CT和TT型個(gè)體（P＜0.05）；389位點(diǎn)與6個(gè)性狀均無顯著相關(guān)（P＞0.05）。

2.3 復(fù)合基因型效應(yīng)與相關(guān)性分析 如表3所示，中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)共有6種復(fù)合基因型，復(fù)合基因型與乳脂肪率和乳蛋白率極顯著相關(guān)（P＜0.01），與其他4個(gè)性狀無顯著相關(guān)（P＞0.05），其中CTCC和TTCC型個(gè)體具有高的乳脂率和乳蛋白率（P＜0.01），TTCC復(fù)合基因型個(gè)體具有相對低的SCS（P＞0.05）。

3 討 論

對ITGB2基因研究較多的主要原因是該基因突變與LAD有關(guān)。在牛上，ITGB2基因編碼區(qū)383位點(diǎn)突變A＞G[13]導(dǎo)致細(xì)胞外的高度保守區(qū)糖蛋白128位天冬氨酸被甘氨酸（D128G）取代[14]，致使白細(xì)胞表面的β2整合素表達(dá)缺陷，引起牛白細(xì)胞增多等BLAD先天性免疫缺陷病。ITGB2基因D128G突變也在巴基斯坦瘤牛和牛的雜交群體[15]以及印度的水牛群體[6]中發(fā)現(xiàn)。除了D128G突變外，ITGB2基因外顯子5的6個(gè)突變，包括1個(gè)沉默突變（435C＞T）和5個(gè)錯(cuò)義突變（338T＞C[V113A]、340G＞T[A114S]、347A＞G[N116S]、348T＞C [N116S] 和359G＞A[R120Q]）也在巴基斯坦瘤牛和牛的雜交群體BLAD牛中檢測到[15]。在狗上，在愛爾蘭雪達(dá)犬LAD個(gè)體中檢測到ITGB2基因107G＞C（C36S）突變[4,7]。在人上，ITGB2基因的諸多突變被報(bào)道，F(xiàn)athallah等[9]在人近親群體LAD患者中發(fā)現(xiàn)了ITGB2基因4個(gè)突變，Taghizade等[16]和Yassaee等[17]分別在伊朗LAD患者和LAD家庭ITGB2基因中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)純合子突變和14個(gè)突變。本研究中，利用SNaPshot技術(shù)在中國荷斯坦奶牛群體中檢測到ITGB2基因2個(gè)無義突變389C＞T和 774C＞T。

表1 中國荷斯坦ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)基因型、等位基因頻率和哈代溫伯格平衡檢測

候選基因與性狀的相關(guān)性分析能幫助揭示生產(chǎn)性狀的遺傳基礎(chǔ)，并且與其他基因技術(shù)相比，該技術(shù)檢測便捷且在育種過程中更容易操作[18]。就ITGB2基因而言，D128G突變是造成牛和水牛LAD的主要原因[6,15,19]。通過LAD患病個(gè)體與健康個(gè)體ITGB2基因序列比較，發(fā)現(xiàn)除D128G之外的其他突變與狗[4,7]和人[9]的LAD有關(guān)。在本研究中，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，前期在中國荷斯坦奶牛群體SCC極端個(gè)體ITGB2基因序列比對分析中發(fā)現(xiàn)的389C＞T和774C＞T突變與奶牛SCS無顯著相關(guān)，說明這2個(gè)位點(diǎn)與BLAD無關(guān)，不能用于奶牛乳房炎抗性育種中；然而在774C＞T位點(diǎn)，攜帶CC基因型的個(gè)體比攜帶CT和TT基因型的個(gè)體乳蛋白率更高，說明774C＞T位點(diǎn)的CC基因型可以作為中國荷斯坦乳品質(zhì)的一個(gè)潛在的分子標(biāo)記。

眾所周知，單個(gè)SNP的基因型可能會影響到臨近SNP的基因型，復(fù)合基因型能夠反映多個(gè)SNP間的互作[20]。因此，復(fù)合基因型的效應(yīng)要優(yōu)于單個(gè)基因型，這是因?yàn)榛蛐椭g的連鎖遺傳效應(yīng)較單個(gè)SNP更為高效[21]。本研究在中國荷斯坦群體ITGB2基因389C＞T-774C＞T位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了6種復(fù)合基因型，并且復(fù)合基因型與乳蛋白率和乳脂率極顯著相關(guān)，其中CTCC和TTCC復(fù)合基因型個(gè)體有更高的乳脂率和乳蛋白率；更重要的是，TTCC復(fù)合基因型個(gè)體具有更低的SCS。該結(jié)果暗示在中國荷斯坦群體中增加ITGB2基因389C＞T-774C＞T位點(diǎn)TTCC基因型有望在提升乳品質(zhì)的同時(shí)降低SCS。

表2 中國荷斯坦奶牛ITGB2基因2個(gè)SNP位點(diǎn)SCS和產(chǎn)奶性狀的效應(yīng)

表3 Smad3基因第6、7外顯子與京海黃雞體重的關(guān)聯(lián)分析 g

4 小 結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦奶牛ITGB2基因389C＞T和774C＞T位點(diǎn)復(fù)合基因型主要與產(chǎn)奶性狀而非乳房炎抗性有關(guān)。在奶牛育種中，ITGB2基因TTCC基因型是提高乳蛋白率、乳脂率和乳房炎抗性潛在的分子標(biāo)記。