TALEN介導(dǎo)的foxo3a敲除小鼠的表型分析

趙鮮紅，劉福航，陳忠毅，高亞可，崔奎青*，石德順*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2.武漢黃浦中西醫(yī)結(jié)合婦產(chǎn)醫(yī)院，湖北武漢 430000）

foxo3a是叉頭框蛋白O亞家族的核心，foxo3a位于第6號染色體上，其cDNA全長2.8 kb，有2個內(nèi)含子，3個外顯子，一共編碼673個氨基酸[1]，其結(jié)構(gòu)上包含第32位蘇氨酸、第253位和第315位絲氨酸3個重要的磷酸化位點(diǎn)。foxo轉(zhuǎn)錄因子參與很多不同的生物進(jìn)程，包括新陳代謝、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、長壽、生殖等[2-6]。foxo3a–/–雌鼠卵巢出現(xiàn)一些獨(dú)特的表型—大范圍卵泡激活，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡、功能型卵巢卵泡的早期損耗及繼發(fā)性不孕。foxo3a在最早期卵泡生長發(fā)育階段作為卵泡發(fā)育的抑制因子，另外，foxo3a為研究卵泡生長調(diào)控提供了一個分子入口。各位學(xué)者對foxo3a的研究為治療婦女卵巢功能早衰、不孕不育提供了可能[7]。據(jù)文獻(xiàn)報道，foxo3a還能夠保護(hù)神經(jīng)免受氧化應(yīng)激的損傷并與神經(jīng)修復(fù)有關(guān)[8-9]；foxo3a是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的抑癌基因[10]，其磷酸化及亞細(xì)胞定位和腫瘤侵襲密切相關(guān)[11]；另外，foxo3a一直被認(rèn)為是長壽基因，具有抗衰老、延長壽命的功能[12]。foxo3a在參與這些生物學(xué)進(jìn)程時，主要是通過PI3K/AKT通路，具體過程是磷酸化的PI3K激活A(yù)KT，AKT進(jìn)而激活磷酸化的foxo3a使其與胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白14-3-3特異性結(jié)合，從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿，經(jīng)過泛素化降解，喪失正常的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低細(xì)胞凋亡[13]；然而當(dāng)抑制AKT途徑時，去磷酸化foxo3a大部分進(jìn)人胞核，最終加速細(xì)胞凋亡。foxo3a通過激活促凋亡蛋白Bim和FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。活化的foxo3a可以升高p27kip1的mRNA以及蛋白水平，抑制周期素依賴性激酶D1，人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclinE-CDK2）復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞周期停留于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

foxo3a敲除早已在豬、牛、小鼠等動物上進(jìn)行研究，但都主要集中在早期卵泡募集上，對foxo3a敲除動物繁殖力表型研究的報道很少。鑒于此，本研究主要統(tǒng)計(jì)不同foxo3a敲除小鼠產(chǎn)仔數(shù)并分析原因，為制備foxo3a敲除水牛、黃牛等大型家畜以提高其繁殖力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 TALEN介導(dǎo)的foxo3a敲除小鼠和WT小鼠，均來自廣西大學(xué)亞熱帶生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室石德順課題組。

1.2 載體和菌種 pMD18-T和感受態(tài)宿主E.coli DH5α均購自TaKaRa公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Markers、DEPC等均購自天根生化科技有限公司；TRIzol裂解液購自Invitrogen公司；Fast Start Universal SYBR GreenMaster（ROX） 購 自 Roche公司；Oligod（T）18T購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PSTI酶、Taq酶、LA Taq酶、GC Buffer、RNase inhibitor購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；氨芐青霉素鈉購自Solarbio公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂購自北京奧博星；普通瓊脂糖（BIOWEST AGAROSE）為進(jìn)口分裝產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的小鼠序列，利用Oligo6.71軟件分別設(shè)計(jì)了TALEN介導(dǎo)的foxo3a敲除小鼠后代陽性鑒定所用引物mFtln1和小鼠QRT-PCR所用引物DL-foxo3a。mFtln1-F:5'-AGCACAGATGGG TACTGCTT-3'；mFtln1-R:5'-ACCTGTCCTATGCCGAC C-3'；擴(kuò)增片段長度為653 bp，退火溫度55℃。DL-foxo3a-F:5'-TACGGCAACCAGACACTCC-3'；DL-foxo3a-R:5'-TTCTGATTGACCAAACTCCC-3'；擴(kuò)增片段長度為203 bp，退火溫度58℃。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.2 小鼠基因組提取 基因組的提取參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南·第三版》[14]。

1.4.3 小鼠陽性鑒定 小鼠基因組普通PCR產(chǎn)物在華大生物公司進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果用DNASTAR-seqMan分析。

1.4.4 總RNA的提取及cDNA的合成 采用TRIZol法提取小鼠卵巢和睪丸的RNA，隨后用分光光度計(jì)及1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性，并置于-80℃保存，備用。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 2 μg，2XTS Reaction mix 10 μL，Trans script?；RT/RT EnZyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，Oligod（T）18T 1 μL，RNase-free Water補(bǔ)充至 20 μL。反應(yīng)條件：42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 終止。

1.4.5 QRT-PCR反應(yīng) QRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 產(chǎn)物 100～300 ng，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物（10 mol/L）各0.3 μL，用dd H2O補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s并在72℃時收集熒光，共40個循環(huán)，實(shí)驗(yàn)對每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，運(yùn)用2-ΔΔCt的方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，用內(nèi)參GAPDH對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將WT小鼠卵巢和睪丸組織作為對照品，其他為實(shí)驗(yàn)組樣品。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析和LSD多重比較，所有計(jì)算結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠后代陽性鑒定與陽性率統(tǒng)計(jì) foxo3a敲除小鼠經(jīng)過傳代培養(yǎng)用于本研究。TALEN介導(dǎo)的foxo3a敲除技術(shù)得到很多種foxo3a敲除小鼠模型，但是經(jīng)過繁殖僅剩下51 bp片段敲除的模型。foxo3a序列設(shè)計(jì)了1個TALEN位點(diǎn)（表1）。

因?yàn)閒oxo3a-/+小鼠PCR擴(kuò)增的DNA雙鏈中，其中1條鏈缺失了51 bp，所以瓊脂糖凝膠電泳會顯示2條相差51 bp的條帶，而WT小鼠僅有擴(kuò)增出來的653 bp片段（圖1）；對WT小鼠基因組擴(kuò)增出來的653 bp用DNAMAN分析酶切位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)在第270位、第285位、第543位有PSTI酶切位點(diǎn)，其中第270位、第285位酶切位點(diǎn)在發(fā)現(xiàn)敲除的51 bp目標(biāo)序列上，故WT小鼠的DNA序列僅能酶切為110 bp和260 bp左右的2條帶；foxo3a-/+小鼠的DNA序列能酶切為543、110、260 bp左右的3條帶；foxo3a-/-小鼠DNA序列僅能酶切為543 bp和110 bp 2條帶（圖2）；進(jìn)一步驗(yàn)證陽性小鼠，并對測序結(jié)果用DNASTAR-seqMan分析，foxo3a-/-小鼠和foxo3a-/+小鼠測序結(jié)果均會出現(xiàn)51 bp堿基的缺失（圖3）。

表1 foxo3a-TALEN位點(diǎn)

圖1 小鼠陽性鑒定PCR

圖2 PSTI酶切圖

foxo3a-/++ WT后代單敲陽性率為50.00%，陽性率基本符合孟德爾遺傳定率（表2）；foxo3a-/++foxo3a-/+后代單敲陽性率為55.74%，，雙敲陽性率為19.67%，總陽性率為75.41%，陽性率符合孟德爾遺傳定率（表3）。

2.2 不同基因型小鼠產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì) 由表4可見，相對WT小鼠，foxo3a-/-小鼠和foxo3a-/+小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著下降（P＜0.05）；但是foxo3a-/-小鼠和foxo3a-/+小鼠產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 測序結(jié)果 DNASTAR-seqMan分析圖

2.3 不同基因型小鼠卵巢及睪丸內(nèi)foxo3a基因mRNA表達(dá)量 由圖4A知，foxo3a基因 mRNA在foxo3a-/+小鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)量下降；由圖4B知，foxo3a基因mRNA在foxo3a-/+小鼠和WT小鼠睪丸內(nèi)的表達(dá)量無顯著差異。

圖4 foxo3a-/+小鼠、WT小鼠卵巢、睪丸內(nèi)foxo3a基因mRNA的表達(dá)量

由圖5A知，foxo3a基因 mRNA在foxo3a-/-小鼠睪丸內(nèi)的表達(dá)量升高；由圖5B知，foxo3a基因 mRNA在foxo3a-/-小鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)量下降。

2.3 不同基因型小鼠卵巢切片HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，出生后17周的WT小鼠卵巢內(nèi)還有大量的原始卵泡和初級卵泡；而出生后17周的foxo3a-/+小鼠卵巢內(nèi)幾乎沒有原始卵泡和初級卵泡，僅有少量的成熟卵；但是兩者的成熟卵泡結(jié)構(gòu)無明顯差異；foxo3a-/-小鼠相比foxo3a-/+小鼠，卵巢內(nèi)卵泡更少（圖6）。

表2 foxo3a-/++WT小鼠后代陽性率

表3 foxo3a-/++foxo3a-/+小鼠后代陽性率

表4 不同類型小鼠產(chǎn)仔數(shù)

圖5 foxo3a-/-小鼠、WT小鼠睪丸、卵巢內(nèi)foxo3a基因mRNA的表達(dá)量

圖6 出生后17周WT小鼠、foxo3a-/+小鼠、foxo3a-/-小鼠卵巢切片（40×）

3 討 論

foxo3a參與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡與分化、DNA修復(fù)、細(xì)胞抗逆性及活性氧（ROS）解毒等生理過程。研究認(rèn)為，foxO超家族成員中foxo1、foxo3a、foxo4、foxo6是高度保守的PI3K-AKT信號通路中非常重要的下游基因，在造血系統(tǒng)中，PI3K信號通路能調(diào)節(jié)白血病和自身免疫缺陷病的發(fā)病機(jī)制，破壞PI3K信號通路會造成免疫缺陷，但是敲除任何一個foxO家族成員，不會出現(xiàn)造血表型異常敲除foxo1、foxo3a、foxo4，造血干細(xì)胞會出現(xiàn)明顯的缺陷。foxo1敲除動物在胚胎發(fā)育的10.5 d會出現(xiàn)胚胎死亡由于血管生成異常[15]；foxo4敲除動物是可育的而且沒有明顯的表型[16]；foxo3a敲除動物在出生后15周不育是因?yàn)槁殉矁?nèi)原始卵泡大范圍募集隨后卵母細(xì)胞耗盡[17-18]，而且foxo3a敲除動物模型會出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增生和炎癥[19]。因此，如何調(diào)控foxo3a的表達(dá)，促進(jìn)動物發(fā)情周期多排卵進(jìn)而提高水牛等大型經(jīng)濟(jì)動物的繁殖力是值得研究的課題。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的foxo3a 51 bp敲除小鼠為模型，對其后代進(jìn)行基因型鑒定并統(tǒng)計(jì)后代的陽性率，發(fā)現(xiàn)foxo3a-/+小鼠和WT小鼠交配，后代陽性率約為50.00%；foxo3a-/+小鼠和foxo3a-/+小鼠交配，后代陽性率大概為76.74%，符合孟德爾遺傳定律，同時也表明小鼠陽性鑒定的正確性。對不同基因型小鼠進(jìn)行產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)foxo3a-/-小鼠和foxo3a-/+小鼠產(chǎn)仔數(shù)相比野生型來說，均明顯下降。而且foxo3a-/-小鼠和foxo3a-/+小鼠產(chǎn)仔數(shù)卻沒有顯著差異。18周以后小鼠處于老齡化階段，統(tǒng)計(jì)了出生后7周至25.5周的foxo3a-/+雌鼠產(chǎn)仔數(shù)，結(jié)果foxo3a-/+雌鼠沒有出現(xiàn)隨年齡增長產(chǎn)仔數(shù)下降的趨勢，也沒有隨年齡增長而出現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)提高的現(xiàn)象。QRT-PCR結(jié)果表明，foxo3a mRNA在WT小鼠的心臟、肝臟、肺、肌肉、骨骼、腎臟、卵巢和睪丸均有表達(dá)，在肺和卵巢內(nèi)高表達(dá)，表明foxo3a分布廣泛，在小鼠的肺和卵巢組織起著重要作用。foxo3a mRNA在foxo3a-/+小鼠卵巢內(nèi)表達(dá)量顯著下降，在睪丸內(nèi)的表達(dá)量和WT小鼠相比無明顯差異；foxo3a mRNA在foxo3a-/-小鼠卵巢內(nèi)表達(dá)量顯著性下降，在foxo3a-/-小鼠睪丸內(nèi)表達(dá)量卻顯著增加。這可以從定量角度說明小鼠產(chǎn)仔數(shù)下降和小鼠卵巢及睪丸內(nèi)的foxo3a mRNA表達(dá)量下降有直接關(guān)系，可能是因?yàn)榍贸?1 bp片段編碼的氨基酸正好包括foxo3a結(jié)構(gòu)域中非常重要的第32位蘇氨酸位點(diǎn)，造成PI3K-AKT-FOX通路受阻，foxo3a不能和細(xì)胞核內(nèi)的14-3-3蛋白結(jié)合，不能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中只能停留在細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游的細(xì)胞凋亡因子BIM、FASL、TRAIL、SOD2以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinG2、P27、CyclinD促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期，造成單敲和foxo3a-/-小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)量少，排卵率低從而造成單敲和foxo3a-/-小鼠產(chǎn)仔數(shù)下降。

一般情況下，小鼠卵巢卵泡發(fā)生規(guī)律如下：出生后7 d，小鼠的始基卵泡池形成，并且初級卵泡開始形成；出生后3周，小鼠斷奶；出生后5周至7周，小鼠的性成熟階段；出生后9周至12周，小鼠的最佳繁殖期。由于飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件不同，小鼠性成熟日齡也有所差異，一般雌性為35～50日齡，雄性為45～60日齡。一般在出生后2～3個月，小鼠呈現(xiàn)體成熟，此時小鼠體重增長緩慢，是小鼠的最佳配種年齡。本實(shí)驗(yàn)采集17周齡的WT雌鼠、foxo3a-/+雌鼠及foxo3a-/-雌鼠的卵巢用于卵巢切片，并對切片進(jìn)行HE染色，觀察不同基因型小鼠卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育情況。HE染色顯示，出生后17周的WT小鼠卵巢內(nèi)還有大量的原始卵泡和初級卵泡，而foxo3a-/+小鼠卵巢內(nèi)幾乎沒有原始卵泡和初級卵泡，但是兩者的成熟卵泡結(jié)構(gòu)無明顯差異，這也解釋了foxo3a-/+小鼠產(chǎn)仔數(shù)下降是由于體內(nèi)foxo3a基因減少進(jìn)一步造成卵巢內(nèi)卵泡減少、小鼠排卵率下降造成的。

本研究中，foxo3a-/+雄性小鼠的睪丸中foxo3a相對表達(dá)量和WT小鼠睪丸中相對表達(dá)量差異不明顯，而雌性卻差異明顯；foxo3a-/-小鼠雌性卵巢內(nèi)的foxo3a相對表達(dá)量比WT小鼠少，而foxo3a-/-小鼠雄性睪丸內(nèi)foxo3a表達(dá)量卻是WT小鼠的30倍左右，這可能是雌性和雄性體內(nèi)的激素表達(dá)不同及foxo3a參與的各種信號通過共同影響的結(jié)果。