吉得寧 ， 宿玲恰 ， 吳 敬 ， 吳 丹 *

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

磷脂酶 （phospholipase，NCBI，EGU84973.1）是可以將磷脂水解為小分子脂肪酸、甘二酯和磷酸膽堿的一類酶的簡稱[1]。目前磷脂酶被應(yīng)用在很多方面，例如制作面包、蛋黃[2]、植物油的精煉等方面，特別突出的是在油脂脫膠方面[3]。與傳統(tǒng)的物理脫膠方法相比，酶法脫膠可以大大減少化學(xué)品的消耗和幾乎不產(chǎn)生任何廢水，形成了一種經(jīng)濟(jì)，高效，穩(wěn)定的綠色油脫膠工藝。過去的幾十年中，由于磷脂酶具有的巨大商業(yè)價(jià)值，吸引了大量的研究。國內(nèi)外關(guān)于磷脂酶制備的研究主要集中于磷脂酶基因在異源宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，來源于米曲霉[4]、釀酒酵母[5]、粗糙脈孢菌[6]的磷脂酶基因，已經(jīng)成功克隆表達(dá)。據(jù)報(bào)道，磷脂酶基因異源表達(dá)的宿主包括大腸桿菌[7]、米曲霉、釀酒酵母[4]、黑曲霉[8]等，主要通過發(fā)酵優(yōu)化提高磷脂酶的表達(dá)水平。

來源于尖孢鐮刀菌的磷脂酶基因，目前并未有報(bào)道該基因在P.pastoris中克隆表達(dá)和優(yōu)化，為了提高磷脂酶的表達(dá)量，本文選擇高表達(dá)量的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[9-10]。甲醇利用型巴斯德畢赤酵母具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌、容易放大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，已被廣泛用于表達(dá)多種蛋白[11]。近年來研究在重組畢赤酵母中，表達(dá)另外一種酶可以提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。在酵母、霉菌、植物等生物體中發(fā)現(xiàn)一種N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Mpr1）[12]。Mpr1是一類能催化乙?；鶊F(tuán)在乙酰輔酶A和胺之間轉(zhuǎn)移的酶。Mpr1具有顯著的抗ROS氧化脅迫生理功能，增加溫度耐受度[13]，以及凍干耐受度[14]等，從而顯著提高細(xì)胞活性，提高磷脂酶在畢赤酵母中的表達(dá)量。

前期工作發(fā)現(xiàn)來源于尖孢鐮刀菌的磷脂酶基因，具有很好的穩(wěn)定性和應(yīng)用性，構(gòu)建磷脂酶在畢赤酵母中克隆表達(dá)的重組菌。在前期工作的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高磷脂酶在畢赤酵母中的表達(dá)量，本研究構(gòu)建了N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中表達(dá)的重組畢赤酵母菌株，并探究其在3.6 L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)磷脂酶的最佳條件，為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase菌株和重組質(zhì)粒pPICZA-Mpr1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。P.pastoris表達(dá)質(zhì)粒pPICZA購于美國Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。

BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素 4×10-4g/L，甲醇 40 g/L。

BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油 10 g/L，生物素 4×10-4g/L。

種子培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，YNB 13.4 g/L，甘油 30 g/L。

BSM培養(yǎng)基：85%磷酸 26.7 ml/L，二水硫酸鈣0.93 g/L，硫酸鉀 18.2 g/L。

七水硫酸鎂 14.9 g/L，氫氧化鉀 4.13 g/L，甘油30 g/L，PTM1 4.35 ml/L。

PTM1低鹽溶液：硫酸銅 6 g/L，碘化鉀 0.08 g/L，一水硫酸錳 3.0 g/L。

鉬酸鈉 0.2 g/L，硼酸 0.2 g/L，氯化鈷 0.5 g/L，氯化鋅 20.0 g/L，七水硫酸亞鐵65.0 g/L，生物素0.2 g/L，濃硫酸 5.0 ml/L。

補(bǔ)料生長培養(yǎng)基：質(zhì)量濃度為500 g/L的甘油（含 12 ml/L PTM1）。

甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基：100%甲醇 （含 12 ml/L PTM1）。

1.1.3 試劑 蛋白胨、酵母抽提物購自O(shè)xiod，酵母無氨基基本氮源培養(yǎng)基（YNB）、遺傳霉素G418購自上海生工生物工程公司。其他均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)購自蘇州科盛有限制造公司；恒溫水浴搖床購自江蘇金壇億通電子有限公司；凝膠成像儀、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；3.6 L Infors全自動(dòng)發(fā)酵罐購自伊孚森生物技術(shù)有限公司（中國）；FC-2002型甲醇濃度檢測流加儀購自上海蘇波信息技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-MPR1的構(gòu)建與篩選 載體的線性化通過使用限制性內(nèi)切酶Sac I進(jìn)行，酶切體系（60 μL）如表 1 所示。

表1 酶切體系Table 1 Digested system

上述各組分充分混勻，37℃水浴約2 h，然后進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，凝膠成像儀下看目的片段，正確后膠回收。

（1）將 6 μL左右的線性化 DNA 加入 80 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)至提前預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置電壓2 500 V，快速電擊，將電擊時(shí)間控制4～10 ms。

（2）結(jié)束后將1 mL 1 mol/L山梨醇（提前預(yù)冷）迅速與菌體充分混勻，然后將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌EP中，30℃、50 r/min溫浴約 2 h。

（3）將上述處理好的菌液均勻涂布在含質(zhì)量濃度0.5 mg/mL遺傳霉素（G418）抗性MD平板上，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，直至長出單菌落。

（4）牙簽挑取MD平板上的菌落，點(diǎn)種到Y(jié)PD平板（Zeocin抗性）上，分別將Zeocin質(zhì)量濃度梯度設(shè)為 0.5，1，2 mg/mL。

（5）挑取Zeocin抗性質(zhì)量濃度為2 mg/mL平板上的轉(zhuǎn)化子接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基 （10 mL）中，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h左右，進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶 搖瓶發(fā)酵：從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。然后取2.5 mL轉(zhuǎn)接BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至BMMY，加入甲醇于30℃進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后120 h取樣測酶活，誘導(dǎo)120 h時(shí)，離心取得上清即為粗酶。

1.2.3 種子搖瓶培養(yǎng) 從甘油管中接200 μL菌液于100 mL發(fā)酵種子培養(yǎng)基中（100 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶），于30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.4 補(bǔ)料高密度共表達(dá)發(fā)酵 甘油分批發(fā)酵階段：將發(fā)酵種子培養(yǎng)基中菌液按10%接種量接入裝有900 mL BSM培養(yǎng)基的3.6 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)（以25%氨水控制pH 5.0，溫度30℃），調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧在30%以上。

甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段：當(dāng)甘油耗盡（約18 h）時(shí)溶氧（DO）迅速上升，此時(shí)通過溶氧反饋調(diào)節(jié)以16.3 mL/（L·h）的流速控制流加補(bǔ)料生長培養(yǎng)基。

甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵階段：當(dāng)菌體達(dá)到一定質(zhì)量濃度后停止補(bǔ)料，并讓菌體饑餓約30～60 min，然后通過FC2002型甲醇監(jiān)測流加控制器 （華東理工大學(xué)，上海）控制流加可維持恒定質(zhì)量濃度的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)凝乳酶的表達(dá)。發(fā)酵控制過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.2.5 菌體生物量的測定 采用比色法，將菌液稀釋到一定倍數(shù)后用Bio-photometer于波長600 nm處以去離子水為對(duì)照進(jìn)行比色測定，以波長600 nm吸光度的數(shù)值在0.2～0.8之間為原則，OD600=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)，確定OD600的數(shù)值。稱量干燥的5 mL離心管，取4 mL菌液放于其中，離心去上清，然后在105℃下烘干至恒重，稱量并計(jì)算菌體質(zhì)量濃度。

1.2.6 蛋白含量的測定 重組P.pastoris發(fā)酵液中總蛋白含量的測定采用Bradford法，以牛血清蛋白為表樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 磷脂酶酶活測定方法 將200 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到10 mL含有大豆卵磷脂的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0）中，使大豆卵磷脂的終質(zhì)量濃度為40 g/L。振蕩混勻后置55℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，加入終止劑95%的乙醇，振蕩，加入100 μL的酚酞，然后于自動(dòng)滴定儀下用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，觀察顏色，確定空白顏色變色臨界點(diǎn)為滴定的終點(diǎn)，將樣品與空白滴定后的顏色一致，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。磷脂酶酶活力定義為：在特定條件下 1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol量游離脂肪酸所需的酶量即為一個(gè)磷脂酶活力單位（U）。

計(jì)算公式為其中，X為樣品的酶活力，U/mL；V為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為滴定空白時(shí)消耗的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L，50～0.05 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；n為酶液樣品的稀釋倍數(shù)；t為測定酶活時(shí)的反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果和討論

2.1 重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的構(gòu)建和搖瓶發(fā)酵

2.1.1 重組菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的構(gòu)建和篩選 將前期工作構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPICZA-Mpr1（圖1），用Sac I線性化[15]，然后電轉(zhuǎn)至 P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase感受態(tài)細(xì)胞，由于在P.pastoris染色體中已經(jīng)有pPIC9K-phospholipase（圖2），其攜帶有G418抗性基因，可直接涂布G418抗性質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL MD平板[16]。挑取抗性MD板上長出的重組轉(zhuǎn)化子，點(diǎn)接到Zeocin抗性質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2 mg/mL的抗性YPD平板中。表達(dá)載體pPICZA有Zeocin抗性，可以通過篩選重組菌抗Zeocin的能力來獲得高拷貝數(shù)目的基因轉(zhuǎn)化子，最后在2 mg/mL Zeocin抗性質(zhì)量濃度的YPD平板上挑選出轉(zhuǎn)化子。

2.1.2 重組菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的搖瓶產(chǎn)酶 將篩選出來的重組畢赤酵母菌株搖瓶發(fā)酵，誘導(dǎo)120 h后表達(dá)磷脂酶胞外酶活達(dá)到最大值為850 U/mL，是前期磷脂酶單獨(dú)表達(dá)胞外上清酶活的1.3倍。重組菌株表達(dá)的磷脂酶的SDS-PAGE電泳（圖3）顯示，在30 kDa處有目的蛋白條帶，與理論的磷脂酶分子量相符合。綜上所述：Mpr1在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中的表達(dá)可以提高磷脂酶的表達(dá)量。

圖1pPICZA-Mpr1重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 pPICZA-Mpr1 recombinant plasmid map

圖2 pPIC9K-phospholipase重組質(zhì)粒圖譜Fig.2 pPIC9K-phospholipase recombinant plasmid map

2.2 3.6 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶

圖3 Mpr1和磷脂酶重組菌胞外上清液聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of the extracellular supernatant in the recombinant strain

2.2.1 不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長及產(chǎn)磷脂酶的影響 P.pastoris高密度發(fā)酵是工業(yè)化生產(chǎn)外源重組蛋白的一個(gè)重要途徑。溫度是影響菌體生長和目的蛋白表達(dá)的很重要的因素[17-18]。升高溫度，有利于菌體的生長，過高的溫度將會(huì)影響菌體正常的生長和目的蛋白的表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)研究了在3.6 L發(fā)酵罐中菌體質(zhì)量濃度為40 g/L開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%，誘導(dǎo)溫度分別為28，30，32℃三個(gè)條件，進(jìn)行誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化。

如圖4所示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28、30℃時(shí)，菌體的生長是隨著時(shí)間的增加而逐漸遞增的，在誘導(dǎo)110 h后菌體濃度趨于穩(wěn)定，分別為201、199 g/L。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為32℃時(shí)，誘導(dǎo)0～90 h菌體的生物量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間在90～120 h時(shí)，發(fā)酵后期菌體的濃度開始逐漸降低，最后誘導(dǎo)120 h的菌體生物量為182 g/L。當(dāng)誘導(dǎo)溫度超過30℃，可能由于溫度過高，影響菌體的生長，菌體開始裂解，所以應(yīng)將誘導(dǎo)溫度控制在30℃以下。

如圖5所示，磷脂酶的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度的降低，表達(dá)量越高。誘導(dǎo)溫度從28℃增加到30℃時(shí)，誘導(dǎo)120 h后，磷脂酶的酶活由8 100 U/mL降為6 050 U/mL。當(dāng)誘導(dǎo)溫度從30℃增加到32℃時(shí)，磷脂酶的酶活由6 050 U/mL降為5 100 U/mL。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，誘導(dǎo)120 h的蛋白表達(dá)量分別為8.3 mg/mL，分別是誘導(dǎo)溫度為 30、32℃的1.32、1.56倍。由此得知，誘導(dǎo)溫度越低，酶的蛋白表達(dá)量越高。較低的溫度誘導(dǎo)，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜和更加有效地降低蛋白酶的水解率，從而提高酶的表達(dá)量[19]。工業(yè)生產(chǎn)上誘導(dǎo)溫度低于28℃，具有生產(chǎn)成本高、制冷設(shè)備的承受能力要求高和工藝的可放大性可能性小的缺點(diǎn)，所以重組菌最優(yōu)的發(fā)酵條件為28℃。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度菌體生長的影響Fig.4 Effect of different temperatures on cell growth during the induction phase

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)磷脂酶表達(dá)的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.2 不同的初始誘導(dǎo)生物量對(duì)菌體生長及產(chǎn)磷脂酶的影響 不同的初始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度對(duì)于產(chǎn)酶的影響是很關(guān)鍵的[20]。通常情況下外源蛋白的最終表達(dá)量與初始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度成正比，菌體質(zhì)量濃度越高，蛋白的表達(dá)量就越高[21]，但是當(dāng)生物量達(dá)到過高水平時(shí)，培養(yǎng)條件容易受到制約，外源蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性也會(huì)受到影響。為考察初始菌體質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)磷脂酶的影響，本研究在3.6 L罐中初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的甘油耗盡，開始指數(shù)流加不同體積的甘油，至菌體質(zhì)量濃度分別達(dá)到20、40、60 g/L三個(gè)不同菌質(zhì)量濃度時(shí)開始誘導(dǎo)；誘導(dǎo)階段通過甲醇電極維持1.0%的甲醇體積分?jǐn)?shù)，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)120 h后，觀察菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的情況。

由圖6可知，在誘導(dǎo)前100 h，初始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長的影響較明顯，但是達(dá)到穩(wěn)定期后菌體質(zhì)量濃度基本保持穩(wěn)定。在初始誘導(dǎo)菌體生物量為60 g/L時(shí)，誘導(dǎo)120 h后生物量達(dá)到最高，同時(shí)結(jié)合圖7可知，當(dāng)初始誘導(dǎo)菌質(zhì)量濃度由20 g/L增加到40 g/L時(shí)，誘導(dǎo)120 h后磷脂酶酶活由6 230 U/mL增加到8 100 U/mL，當(dāng)初始誘導(dǎo)菌質(zhì)量濃度從40 g/L增加到60 g/L時(shí)，磷脂酶酶活則由8 100 U/mL下降到7 250 U/mL，因此初始誘導(dǎo)菌質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)磷脂酶的表達(dá)量最高，最終細(xì)胞質(zhì)量濃度維持在201 g/L左右，此時(shí)磷脂酶的生長情況和產(chǎn)酶情況最優(yōu)。本次研究Mpr1和磷脂酶在P.pastoris中共表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶的表達(dá)量并不是一直和初始誘導(dǎo)菌質(zhì)量濃度成正比，而是在合適的生物量時(shí)誘導(dǎo)能較明顯地提高重組酶表達(dá)量，這樣既能維持細(xì)胞平穩(wěn)生長，又能提高磷脂酶的表達(dá)量。因此本實(shí)驗(yàn)最優(yōu)的初始誘導(dǎo)生物量為40 g/L。

圖6 不同起始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長的影響Fig.6 Effect of different initial induction cell density on cellgrowth and the phospholipaseexpression during the induction phase

圖7 不同起始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度對(duì)磷脂酶表達(dá)的影響Fig.7 Effect of different initial induction cell density on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.3 不同的甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長及產(chǎn)磷脂酶的影響 P.pastoris表達(dá)外源蛋白的過程中，誘導(dǎo)階段甲醇體積分?jǐn)?shù)不僅會(huì)影響細(xì)胞生長，與外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)量也存在很大關(guān)系。甲醇作為誘導(dǎo)階段唯一碳源和誘導(dǎo)劑，通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生甲醇代謝所需醇氧化酶后消耗甲醇為細(xì)胞生長產(chǎn)酶提供能量，同時(shí)誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)，但在代謝甲醇過程中產(chǎn)生的甲醛和，等小分子過氧化物會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，因此如何控制合適的甲醇體積分?jǐn)?shù)是高密度誘導(dǎo)發(fā)酵關(guān)鍵因素之一。本次研究中，初始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度控制在40 g/L、誘導(dǎo)溫度為28℃，探究了不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長及產(chǎn)磷脂酶的影響。

菌體的生長情況如圖8所示，甲醇體積分?jǐn)?shù)維持分別在0.5%、1.0%、1.5%，誘導(dǎo)120 h后菌體質(zhì)量濃度分別為199、200、195 g/L。菌體質(zhì)量濃度大體一致，但是從整個(gè)誘導(dǎo)過程中可以看出甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%比1.5%生長得好，說明在1.5%體積分?jǐn)?shù)甲醇條件下，細(xì)胞生長受到抑制，維持較高體積分?jǐn)?shù)甲醇不利于細(xì)胞生長。

圖9顯示不同甲醇體積分?jǐn)?shù)下細(xì)胞產(chǎn)酶水平變化，甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，磷脂酶的酶活單位是甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.5%的1.14、1.3倍。誘導(dǎo)甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白表達(dá)量高于甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.5%，所以過高的甲醇體積分?jǐn)?shù)不利于酶的表達(dá)。在適合的甲醇體積分?jǐn)?shù)條件下，磷脂酶的酶活和蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。但是較高的甲醇體積分?jǐn)?shù)可能會(huì)產(chǎn)生毒素，影響細(xì)胞中的代謝途徑，導(dǎo)致酶的表達(dá)量降低[22]。所以重組菌發(fā)酵產(chǎn)生磷脂酶最優(yōu)的甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為1.0%。

圖8 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇誘導(dǎo)對(duì)菌體生長的影響Fig.8 Effect of different methanol concentration on cell growth during the induction phase

圖9 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇誘導(dǎo)對(duì)磷脂酶表達(dá)的影響Fig.9 Effect of different methanol concentration on the phospholipaseexpression during theinduction phase

3 結(jié) 語

本研究中構(gòu)建重組菌株P(guān).pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1和重組菌在3.6 L發(fā)酵罐中發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。搖瓶發(fā)酵初步研究得到胞外上清酶活850 U/mL，是前期磷脂酶單獨(dú)表達(dá)的1.3倍。重組P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1菌株進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的探究，通過考察不同的誘導(dǎo)溫度、起始誘導(dǎo)生物量和甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)，確定其最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在溫度為28℃，初始誘導(dǎo)菌體質(zhì)量濃度為40 g/L，1.0%甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)時(shí)高密度發(fā)酵得到發(fā)酵上清的最大酶活可達(dá)到8 100 U/mL。這為后續(xù)磷脂酶進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。