張利華 ， 陳獻(xiàn)忠 *， 陳 振 ， 沈 微 ， 樊 游

(1.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）是一種二倍體非常規(guī)假絲酵母，能夠產(chǎn)生芽管和假菌絲[1]，不存在有性生殖階段，僅存在準(zhǔn)性生殖過程[2]，遺傳背景相對(duì)于釀酒酵母等常規(guī)酵母更為復(fù)雜。目前，熱帶假絲酵母已經(jīng)被成功運(yùn)用于長鏈二元有機(jī)酸的工業(yè)化生產(chǎn)中[3]，并且在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇[4-5]、生物乙醇[6]、氫氣[7]以及工業(yè)有機(jī)廢水處理等方面展現(xiàn)出很高的應(yīng)用潛力。

代謝工程是工業(yè)微生物育種的重要手段，然而熱帶假絲酵母的遺傳操作相較于模式酵母菌株更為困難。Hara等人[8]以密碼子優(yōu)化的潮霉素B抗性基因作為篩選標(biāo)記對(duì)C.tropicalis M12103A雙拷貝的URA3基因進(jìn)行連續(xù)敲除，高弘等人[9]則依次用潮霉素B和G418作為篩選標(biāo)記，對(duì)雙拷貝的CAT基因進(jìn)行破壞，而Lu[10]和Chen[11]等人則采用基于白假絲酵母密碼子優(yōu)化的諾爾絲菌素抗性基因作為篩選標(biāo)記對(duì)熱帶假絲酵母進(jìn)行多基因連續(xù)破壞。然而，龔毅等人[12]的研究表明熱帶假絲酵母CT750菌株對(duì)G418、潮霉素和腐草霉素等抗生素的敏感性較差，不能作為該菌株的顯性篩選標(biāo)記。筆者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明潮霉素或腐草霉素作為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化熱帶假絲酵母ATCC20336也很難成功（未發(fā)表）。此外，熱帶假絲酵母存在密碼子偏好性，將CUG密碼子翻譯成絲氨酸，而非通用密碼子的亮氨酸[13]，進(jìn)一步限制了抗性基因作為篩選標(biāo)記的普適性。

Haas等人[14]通過亞硝基胍誘變篩選獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，然后將其作為宿主建立了最早的熱帶假絲酵母DNA整合轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。利用該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，Picataggio等人[15]對(duì)熱帶假絲酵母β氧化途徑的限速酶POX4和POX5兩對(duì)等位基因進(jìn)行了連續(xù)敲除，獲得了β氧化途徑阻斷的工程菌株，建立了連續(xù)的基因敲除系統(tǒng)。然而，在利用該技術(shù)進(jìn)行多基因刪除時(shí)，每完成一個(gè)基因的單拷貝敲除，就必需通過自發(fā)突變或者分子手段來破壞URA3標(biāo)記，從而達(dá)到在同一細(xì)胞中連續(xù)使用同一篩選標(biāo)記的目的，這即延長了育種周期，增加了工作量，又增加了多基因敲除的難度。Cheng等人[16]通過發(fā)展一種源于釀酒酵母的Ura-blaster基因連續(xù)敲除系統(tǒng)，成功完成了對(duì)熱帶假絲酵母FAOT基因的單拷貝和雙拷貝敲除。這套Ura-blaster基因連續(xù)敲除系統(tǒng)中，URA3基因兩側(cè)分別插入了一段源于沙門氏菌（Salmonella）的1.1 kb的HisG直接重復(fù)序列，當(dāng)攜帶靶基因同源臂的刪除盒整合到染色體后，隨著酵母染色體的復(fù)制，兩段HisG序列會(huì)發(fā)生同源重組從而環(huán)化彈出URA3基因，達(dá)到重復(fù)利用標(biāo)記基因的目的。本實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)崢等人[17]也利用這套轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)PDC基因進(jìn)行了連續(xù)敲除，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的普適性。此外，以一些Ura-blaster的變形形式（如以leu、glu和trp等基因片段替代HisG序列）也被應(yīng)用于熱帶假絲酵母的基因刪除[18-19]，豐富了Urablaster基因刪除系統(tǒng)在熱帶假絲酵母中的應(yīng)用。然而，構(gòu)建DNA刪除盒中較長的重復(fù)序列不僅增加了分子操作的難度，而且在PCR擴(kuò)增時(shí)由于有一定幾率發(fā)生重復(fù)片段的重組，從而也降低了制備目的片段的效率。

本研究選用熱帶假絲酵母ATCC20336的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變菌株XZX為宿主，構(gòu)建了以gda片段作為基因刪除輔助序列的肉毒堿乙?；D(zhuǎn)移酶（CAT）基因刪除突變盒（CAT1-gda-URA3-CAT1和CAT2-gda-URA3-CAT2），利用雙交換的原理，通過氯化鋰轉(zhuǎn)化法兩次轉(zhuǎn)化宿主菌株，獲得CAT基因單拷貝敲除和雙拷貝敲除突變株，并對(duì)CAT的基本功能進(jìn)行了分析，探討其在熱帶假絲酵母烷烴代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與引物 本實(shí)驗(yàn)所涉及到的菌株和引物見表1與表2。熱帶假絲酵母尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株XZX由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)野生型熱帶假絲酵母ATCC20336通過化學(xué)誘變獲得[17]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株Table 1 Strains used in this paper

表2 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物Table 2 Primers used in this paper

1.1.2 主要試劑及工具酶 限制性內(nèi)切酶Pst I、Sal I和Xba I，T4 DNA連接酶等工具酶以及克隆載體pMD18-T載體、pMD18-T Simple載體均購自大連寶生物工程有限公司；5-氟乳清酸 （5-FOA）購自Amresco（美國），酵母粉和蛋白胨購自 OXOID（英國），酵母氮基（YNB）購自 Bio Basic Inc（加拿大），其他試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 MM培養(yǎng)基、SM培養(yǎng)基以及2×FOA培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn) [17]；十二烷培養(yǎng)基：YNB 0.67%，硫酸銨1%，十二烷2%，尿嘧啶0.006%。

1.2 方法

1.2.1 CAT基因敲除突變盒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI中熱帶假絲酵母的CAT基因 （GenBank登錄號(hào)：D84549.1）和 URA3基因 （GenBank登錄號(hào)：AB006207）序列設(shè)計(jì)一系列引物，引物序列和相關(guān)酶切位點(diǎn)見表2。

以質(zhì)粒T-URA3[17]為模板，Ugda324/Dgda為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度為324 bp的基因刪除輔助序列（gda序列），經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pst I和Sal I消化后插入到質(zhì)粒T-URA3中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒T-gda324-URA3。

以熱帶假絲酵母XZX菌株的染色體DNA為模板，CATU/CATR、CAT2ndU/CAT2ndR 為 引 物 ，PCR擴(kuò)增1.9 kb的CAT1和0.9 kb的CAT2基因片段，分別插入pMD18-T Simple載體中，獲得重組質(zhì)粒Ts-CAT1和Ts-CAT2。以質(zhì)粒Ts-CAT1為模板，rCATU/rCATR為引物，通過反向PCR擴(kuò)增獲得具有敲除第一個(gè)CAT等位基因同源臂的線性化DNA片段 （CAT1-Ts-CAT1）；以質(zhì)粒Ts-CAT2為模板（CAT2基因片段位于兩個(gè) CAT1同源臂之間），rCAT2ndU/rCAT2ndR為引物，反向PCR獲得攜帶敲除第二個(gè)CAT等位基因同源臂的DNA片段（CAT2-Ts-CAT2）。

用限制性內(nèi)切酶Pst I和Xba I消化質(zhì)粒T-gda324-URA3，回收gda324-URA3片段，然后分別插入到經(jīng)相應(yīng)酶消化的CAT1-Ts-CAT1和CAT2-Ts-CAT2片段，獲得重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3。以重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3為模板，CATU/CATR為引物，通過PCR獲得敲除第一個(gè)CAT等位基因的敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1；以Ts-CAT2-gda324-URA3為模板，CAT2ndU/CAT2ndR為引物，PCR擴(kuò)增獲得敲除第二個(gè)CAT等位基因的敲除突變盒CAT2-gda324-URA3-CAT2。

1.2.2 酵母的轉(zhuǎn)化與鑒定 熱帶假絲酵母的轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)[17]。將第一個(gè)基因敲除突變盒轉(zhuǎn)化XZX菌株，在基本培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落提取基因組DNA，以CATU和位于CAT1基因片段下游的引物CATLD為引物進(jìn)行PCR鑒定，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子命名為01菌株；01菌株的URA3標(biāo)記基因剔除后獲得突變菌株，命名為02菌株，然后將01菌株和02菌株送上海生工生物工程有限公司測序。轉(zhuǎn)化第二個(gè)CAT基因敲除突變盒進(jìn)入02菌株，以CAT2ndU/CATR為引物進(jìn)行PCR鑒定，驗(yàn)證正確的菌株命名為03；03菌株丟失標(biāo)記基因獲得04菌株，然后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 標(biāo)記基因的剔除 將01菌株的單菌落接種于SM液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)，待菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的后期時(shí)，直接吸取200 μL涂布2×FOA平板，將平板置于30℃培養(yǎng)，3 d后挑取2×FOA平板上單菌落轉(zhuǎn)接到2×FOA培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取染色體DNA并進(jìn)行PCR鑒定。保藏URA3標(biāo)記基因彈出的突變菌株，并用于第二個(gè)CAT等位基因的敲除。03菌株按照同樣的方法剔除標(biāo)記基因。

1.2.4 CAT酶活測定 將熱帶假絲酵母突變株02、04和親本菌株XZX單菌落分別接種于SM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌體達(dá)到一定濃度后轉(zhuǎn)接到添加了2%的十二烷的SM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。參考文獻(xiàn)[20]制備CAT粗酶液，CAT酶活性測定參考文獻(xiàn)[21]報(bào)道的DTNB法。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)方案構(gòu)建攜帶CAT基因敲除突變盒的重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3。 分別用 Pst I/Sal I（329 bp、4 933 bp）和 Pst I/Xba I（1 923 bp、3 339 bp）雙酶切質(zhì)粒 Ts-CAT1-gda324-URA3進(jìn)行鑒定，限制性酶切產(chǎn)物大小與理論值一致，表明重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3構(gòu)建正確 （圖1（a））；重組質(zhì)粒Ts-CAT2-gda324-URA3轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，Xba I酶切位點(diǎn)發(fā)生Dam甲基化，不便于用限制酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序分析正確。

圖1 基因敲除質(zhì)粒與敲除突變盒的鑒定Fig.1 Identification ofrecombinantplasmids and disruption cassettes

2.2 CAT基因敲除突變盒的鑒定與獲得

基因敲除突變盒的獲取方式如圖2（a）所示。以鑒定正確的重組質(zhì)粒為模板，CATU/CATR或CAT2ndU/CAT2ndR為引物，通過PCR擴(kuò)增出CAT基因敲除突變盒CAT1-gda324-URA3-CAT1（2 570 bp）和CAT2-gda324-URA3-CAT2（2 646 bp）（圖 1（b）），PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用于酵母轉(zhuǎn)化。

2.3 熱帶假絲酵母CAT基因的敲除

熱帶假絲酵母CAT基因敲除流程如圖2（b）所示。通過氯化鋰轉(zhuǎn)化法將敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1轉(zhuǎn)化熱帶假絲酵母XZX菌株，從MM培養(yǎng)基平板上挑取長出的轉(zhuǎn)化子單菌落培養(yǎng)后，提取染色體DNA，以CATU/CATLD為引物進(jìn)行PCR鑒定，陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為2.7 kb（圖3，泳道1），對(duì)照（以XZX菌株染色體DNA為模板）大小為2.0 kb（圖 3，泳道 3），鑒定正確菌株命名為01。測序分析發(fā)現(xiàn)01菌株中的一個(gè)CAT基因位點(diǎn)被敲除盒CAT1-gda324-URA3-CAT1替換（測序結(jié)果未列出）。

為重復(fù)利用URA3基因作為篩選標(biāo)記進(jìn)行雙拷貝的CAT基因敲除，將01菌株涂布2×FOA平板，經(jīng)過3 d培養(yǎng)后篩選URA3基因隨機(jī)丟失的突變株。提取2×FOA平板上突變株染色體DNA，以CATU/CATLD為引物進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物大小為1.1 Kb的突變株為URA3標(biāo)記基因彈出突變株（圖3，泳道2），命名為02。測序分析發(fā)現(xiàn)單拷貝的gda序列和兩個(gè)同向gda序列之間的URA3基因片段丟失，僅殘留單拷貝的gda序列。

將第二個(gè)敲除盒CAT2-gda324-URA3-CAT2轉(zhuǎn)化02菌株，按照上述方法提取染色體DNA，以CAT2ndU/CATR為鑒定引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，敲除盒正確整合的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增產(chǎn)物為3.0 kb（圖3，泳道4），對(duì)照菌株P(guān)CR產(chǎn)物大小為1.3 kb（圖3，泳道6），鑒定正確菌株命名為03。03菌株涂布2×FOA平板，篩選獲得標(biāo)記基因丟失菌株，經(jīng)PCR鑒定和DNA測序分析驗(yàn)證正確的菌株命名為04（圖3，泳道5）。

2.4 CAT基因敲除對(duì)菌株生長的影響

圖2 熱帶假絲酵母CAT基因敲除流程圖Fig.2 Sequential gene disruption of CAT in C.tropicalis

圖3 CAT基因敲除菌株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of CAT gene knockout mutants

分別將熱帶假絲酵母突變株02、04和XZX菌株的種子液以一定比例接種于SM液體培養(yǎng)基或?qū)⒎N子用無菌水洗滌后接入十二烷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定OD600，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)葡萄糖為唯一碳源時(shí)，CAT基因單拷貝缺失菌株02的生長狀況與親本一致，而CAT雙拷貝敲除菌株的生物量明顯下降（4（a））。02菌株在以十二烷為唯一碳源時(shí)，生長狀況與親本菌株差異不明顯，而CAT基因的雙缺失導(dǎo)致04菌株無法代謝烷烴（圖4（b））。結(jié)果表明熱帶假絲酵母CAT基因不僅是烷烴β氧化過程所必需，而且CAT雙拷貝缺失也顯著影響突變株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長。由于葡萄糖的代謝過程并不需要CAT的參與，具體的機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

圖4 菌株02、04和XZX的生長曲線Fig.4 Comparison of the growth characteristics of 02，04 and XZX

2.5 CAT基因缺失的功能鑒定

為了考察CAT基因的敲除對(duì)突變株中相應(yīng)酶活力的影響，分別將02、04和XZX菌株接種于添加了2%十二烷的SM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)CAT基因表達(dá)，然后測定胞內(nèi)的CAT酶活力，結(jié)果如圖5所示。相比于親本菌株，02菌株的CAT活力下降了約80%，而在CAT雙缺失菌株中，幾乎檢測不到CAT活性，表明熱帶假絲酵母中的肉毒堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性完全由雙拷貝的CAT基因控制。但是，CAT基因單拷貝缺失突變株02在烷烴為碳源的培養(yǎng)基中的生長速率并沒有受到顯著影響（圖4（b）），推測染色體中單個(gè)CAT基因的表達(dá)已經(jīng)滿足了烷烴β氧化所需的酶活水平。

圖5 熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)CAT活性分析Fig.5 Assay of CAT activity in each strain

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的熱帶假絲酵母基因連續(xù)刪除系統(tǒng)中，為達(dá)到重復(fù)利用單一標(biāo)記基因?qū)ν痪赀M(jìn)行連續(xù)基因刪除的目的，通常在URA3基因兩側(cè)插入兩個(gè)同向重復(fù)的HisG序列，從而在隨后的染色體復(fù)制過程中隨機(jī)同源重組，剔除URA3基因和單拷貝的HisG序列[5，16-17]。然而兩個(gè)1.1 kb的HisG重復(fù)序列很容易在PCR擴(kuò)增過程中發(fā)生高頻率的同源退火反應(yīng)，從而剔除URA3基因，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增基因刪除突變盒時(shí)效率較低，而且兩個(gè)HisG重復(fù)序列還可能導(dǎo)致基因敲除突變盒長度過大，增加PCR擴(kuò)增和后續(xù)轉(zhuǎn)化的難度。

本研究發(fā)展了一種更為高效的多基因刪除策略，即直接從URA3基因的3'端擴(kuò)增一段短片段（gda序列）作為基因刪除輔助序列，直接插入U(xiǎn)RA3基因的5'端（gda-URA3），然后在兩側(cè)連接靶基因的同源臂，利用同源重組的原理對(duì)熱帶假絲酵母菌株進(jìn)行連續(xù)的基因敲除。在所構(gòu)建的基因敲除突變盒中，gda序列與URA3基因中的3'端序列形成同向重復(fù)（圖2），該重復(fù)序列可以在染色體復(fù)制過程中發(fā)生隨機(jī)的同源重組，從而特異性的剔除單拷貝的gda序列和兩段同向的gda序列之間的URA3基因片段。利用此策略，本文成功刪除了熱帶假絲酵母菌株雙拷貝的CAT基因。進(jìn)一步驗(yàn)證了CAT基因刪除對(duì)細(xì)胞的生理影響，結(jié)果表明02菌株的酶活性相比于親本菌株損失了約80%，單拷貝CAT基因的敲除對(duì)菌體生長代謝的影響作用不明顯，推測在熱帶假絲酵母烷烴代謝過程中少量的CAT酶活性足以完成中間產(chǎn)物在線粒體和過氧化物酶體之間的轉(zhuǎn)移。另外，02菌株十二碳二元有機(jī)酸的搖瓶發(fā)酵并不能大量積累有機(jī)酸（數(shù)據(jù)未列出），表明該菌株中的β氧化途徑仍能正常進(jìn)行。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙拷貝CAT基因不僅導(dǎo)致β氧化途徑的中斷，而且顯著影響菌株在葡萄糖為碳源的生長性能。關(guān)于CAT與葡萄糖代謝之間的關(guān)系，尚未有確切的文獻(xiàn)報(bào)道，這將是我們后續(xù)工作的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。此外，本研究所采用的基因刪除輔助序列的大小、位置等因素對(duì)基因刪除效率的影響也是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)木糖醇主要通過玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品的水解、氫化工藝生產(chǎn)[22]，但是該方法生產(chǎn)過程復(fù)雜、安全要求高[23]。熱帶假絲酵母菌的生物轉(zhuǎn)化法是具有潛力的木糖醇生產(chǎn)方法。利用本文建立的基因刪除策略改造熱帶假絲酵母的木糖代謝途徑，提高木糖醇轉(zhuǎn)化效率，是未來發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇的研究方向。