袁君杰薛鋒* 張東倪偉峰殷諾 黃曉燕 肖海軍謝幼專

脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)前常搭配使用1～4周的抗結(jié)核藥 物治療，術(shù)后繼續(xù)應(yīng)用6～9月，以此來加強療效[1]。全身用藥往往難以在病變部位達到有效濃度，同時存在肝腎器官毒副作用[2]。傳統(tǒng)的骨組織缺損修復(fù)主要通過自體骨移植實現(xiàn)，但自體骨來源有限，存在供體部位并發(fā)癥。選擇合適的支架材料結(jié)合抗生素形成藥物緩釋系統(tǒng)可有效解決此類問題，是當前研究的熱點[3-5]。 -磷酸三鈣（ -tricalcium phosphate， -TCP）陶瓷是一種優(yōu)良的骨組織工程支架材料[6]，不僅能用作修復(fù)骨缺損[7,8]，而且在藥物緩釋載體方面的應(yīng)用也受到廣泛關(guān)注[9-11]， -TCP多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部除有微小孔隙外，還有許多明顯的大孔，孔間相互連通，其結(jié)構(gòu)類似正常松質(zhì)骨，合適的孔徑和孔內(nèi)連接確保了其良好的骨傳導性，有利于新骨長入，同時可以釋放藥物。有研究應(yīng)用多孔 -TCP復(fù)合自體干細胞修復(fù)動物[12,13]和患者[14]的椎體骨缺損，效果滿意。

藥物從載體中釋放受到藥物本身、藥物與載體結(jié)合方式、載體孔徑和孔隙率等多種因素制約，目前 -TCP多孔結(jié)構(gòu)區(qū)厚度對藥物釋放的影響尚不明確，為此，本研究設(shè)計制備了含貯藥腔的多孔 -TCP作為藥物緩釋載體，通過直接填充法構(gòu)建了利福平/-TCP藥物緩釋系統(tǒng)，分析其體外藥物釋放特性，明確 -TCP多孔結(jié)構(gòu)厚度對釋藥過程的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

利福平（Sigma-Aldrich，美國）；酶標儀（Synergy HT,Bio-Tek美國）；萬能材料試驗機（Instron，美國）；雙三元液相色譜系統(tǒng)（Ultimate 3000，Dionex，美國）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠，中國）；小牛血清（Gibco，美國）；掃描電鏡（HitachiS-4800，日本）；PMMA顆粒（Lucite International 8FAC15，英國）； -TCP粉劑（LuciteInternational，英國）；XRD（Escalab250Xi，Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

1.2.1 -TCP載體設(shè)計制備及XRD測試

設(shè)計制作2種圓柱狀的多孔 -TCP載體（見圖1），載體直徑為14 mm，高30 mm，載體中心有貯藥腔道，用于貯存藥物，高25 mm，直徑分別為3 mm和8 mm；孔隙率為75%，孔直徑為（500±200） m，孔連接徑為（100±50）m，適合于細胞的黏附、增殖培養(yǎng)和釋放藥物。多孔 -TCP載體是在上海貝奧路生物材料有限公司通過注漿成型法[14]燒結(jié)而成。多孔 -TCP載體的物相組成通過X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）測定（40kv，35mA）。

1.2.2 -TCP載體力學強度測試

使用萬能材料試驗機測定兩種規(guī)格 -TCP載體的縱向壓縮強度（n=5）。將圓柱狀的試樣縱向放置在載物臺上，開動測試機，以2mm/min的恒定速度加載試樣，直至試樣破裂。同理，以磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）為介質(zhì)的藥物緩釋系統(tǒng)，40周后取出 -TCP載體，清除貯藥腔內(nèi)殘留的利福平，檢測干燥后的載體縱向壓縮強度（n=5）。

1.2.3 -TCP載體結(jié)構(gòu)表征測試

選取力學強度測試后完好的 -TCP碎片，表面噴金后使用掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察 -TCP多孔結(jié)構(gòu)區(qū)的表面和斷面形貌并拍照。隨機選取20張低倍（30～100倍）多孔結(jié)構(gòu)SEM圖片，使用Photoshop CC軟件測量大孔和孔內(nèi)連接的數(shù)目、大小，評估單位面積多孔結(jié)構(gòu)的大孔數(shù)及孔內(nèi)連接與大孔數(shù)目之比。同理，觀察測定以PBS為介質(zhì)的藥物緩釋系統(tǒng)40周后 -TCP載體多孔結(jié)構(gòu)大孔和孔內(nèi)連接徑數(shù)目、大小。

1.2.4 體外緩釋實驗

在無菌操作臺內(nèi)，分別往貯藥腔直徑3 mm和8 mm-TCP載體（n=10）內(nèi)各填充0.3 g滅菌后的利福平粉劑。接著用無菌硅膠塞在貯藥腔頂端封口，通過魚線將組裝好的藥物緩釋系統(tǒng)與螺旋玻璃瓶蓋子串聯(lián)，使其可以懸吊在溶液中，然后用游標卡尺測量出距 -TCP載體頂端5mm的位置，在該位置處纏繞一圈魚線。

體外緩釋實驗的浸提介質(zhì)分為兩組，一組以PBS為介質(zhì)（n=5），在玻璃瓶中預(yù)裝200mLpH 7.4的PBS，然后將藥物緩釋系統(tǒng)懸吊在PBS中，液面距 -TCP載體頂端5mm。將整個緩釋裝置靜置于37℃的恒溫箱內(nèi)，每日完全更換等量37℃新鮮PBS。使用酶標儀在波長474 nm處測定洗脫液的吸光度值，根據(jù)利福平溶液的標準曲線，計算溶液中利福平濃度，進而計算每日釋藥量和累積釋藥率。另一組以小牛血清（Calf Serum，CS）為介質(zhì)（n=5），在玻璃瓶中預(yù)裝200 mL CS，然后將藥物緩釋系統(tǒng)懸吊在CS中，液面距 -TCP載體頂端5 mm。將整個緩釋裝置靜置于37℃的恒溫箱內(nèi)，每日微量換液，即每日更換10mL37℃新鮮CS。采用高效液相色譜法測定洗脫液中的利福平濃度，計算每日釋藥量和累積釋藥率。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理。定量資料均采用表示，數(shù)據(jù)采用獨立樣本 檢驗進行檢驗。＜0.05表示差異有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 制備的 -TCP載體

經(jīng)高溫燒結(jié)之后的兩種規(guī)格 -TCP載體如圖1（Ad、Bd）所示。2種多孔 -TCP載體均呈圓柱狀，高30mm，直徑14 mm；載體中央有貯藥腔，高為25 mm，直徑分別為3 mm和8 mm。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP載體質(zhì)量分別為（3.35±0.03）g、（2.25±0.02）g。

圖1，-磷酸三鈣載體設(shè)計圖和實物圖。圖A、B分別為貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -磷酸三鈣載體，圖Aa、Ba為立體設(shè)計圖，Ab、Bb為橫截面設(shè)計圖，Ac、Bc為縱切面設(shè)計圖，Ad、Bd為實物圖。

2.2 -TCP載體XRD測試結(jié)果

制備的 -TCP載體的XRD圖譜如圖2所示，試樣各峰度值與 -TCP標準品一致，表明制備的 -TCP載體的物相組成是由鈣和磷組成的，是純粹的 -磷酸三鈣生物陶瓷制品。

圖2，-磷酸三鈣載體XRD圖。

2.3 -TCP載體力學強度測試結(jié)果

-TCP載體力學強度測試結(jié)果見圖3，原始狀態(tài)的貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP的縱向壓縮強度分別為（1.09±0.05）MPa、（0.71±0.04）MPa（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm多孔 -TCP與貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP相比，其縱向壓縮強度增幅達53.52%±7.04%（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在PBS中浸泡40周后，其縱向壓縮強度分別為（0.62±0.07）MPa、（0.41±0.05）MPa（＜0.05），與緩釋之前相比，其縱向壓縮強度同比下降75.81%±8.06%、73.17%±9.76%（＜0.05）。

圖3，-磷酸三鈣載體緩釋實驗前后力學強度變化圖。*表示＜0.05。

2.4 -TCP載體SEM表征結(jié)果

在 -TCP載體多孔結(jié)構(gòu)表面（如圖4-Aa所示）存在許多大孔，多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部不同的大孔結(jié)構(gòu)可通過孔內(nèi)連接連通。相鄰大孔結(jié)構(gòu)之間為致密結(jié)構(gòu)，致密結(jié)構(gòu)的磷酸三鈣顆粒之間結(jié)合緊密，顆粒棱角分明，邊緣比較銳利，在少數(shù)顆粒之間存在微小的孔隙（見圖4-Ac）。多孔結(jié)構(gòu)表面大孔孔徑為（308.9±19.6） m，孔內(nèi)連接徑為（75.3±12.7） m；單位面積多孔結(jié)構(gòu)表面的大孔數(shù)目為（5.64±0.08）/mm2，孔內(nèi)連接數(shù)目為（9.69±0.02）/mm2，孔內(nèi)連接與大孔數(shù)目之比為1.71±0.01。多孔結(jié)構(gòu)斷面（如圖4-Ab所示）大孔孔徑為（540.7±83.0） m，孔內(nèi)連接徑為（65.3±18.8） m；單位面積多孔結(jié)構(gòu)斷面的大孔數(shù)目為（4.61±0.05）/mm2，孔內(nèi)連接數(shù)目為（12.39±0.22）/mm2，孔內(nèi)連接與大孔數(shù)目之比為 2.69±0.58。多孔結(jié)構(gòu)表面和斷面的大孔平均孔徑為（438.7±133.0） m，平均孔內(nèi)連接徑為（69.6±16.8） m。

經(jīng)過長達40周的體外緩釋后，載體多孔結(jié)構(gòu)表面大孔邊緣較緩釋之前平整、圓滑（見圖4-Ba），孔徑為（399.4±21.3）m，較緩釋前增大 29.30%±6.90（＜0.05）；孔內(nèi)連接徑為（98.7±11.7） m，較緩釋前增大31.08%±15.54（＜0.05）；單位面積多孔結(jié)構(gòu)的大孔數(shù)目為 (4.53±0.02)/mm2，孔內(nèi)連接數(shù)目為（11.59±0.08）/mm2，孔內(nèi)連接與大孔數(shù)目之比為2.56±0.44，與緩釋之前相比，增幅為 49.71%±25.73（＜0.05）。多孔結(jié)構(gòu)斷面（見圖4-Bb）大孔孔徑為708.7±90.2 m，較緩釋 前增 大 31.07%±16.68（＜0.05）；孔內(nèi) 連 接徑 為（164.4±14.2） m，較緩釋前增大 51.76%±21.75（＜0.05）；單位面積多孔結(jié)構(gòu)的大孔數(shù)目為（2.06±0.05）/mm2，孔內(nèi)連接數(shù)目為（6.51±0.01）/mm2，孔內(nèi)連接與大孔數(shù)之比為3.15±0.35，與緩釋之前相比，增幅為 17.10%±13.01（＜0.05）。體外緩釋40周后， -TCP載體多孔結(jié)構(gòu)表面和斷面的大孔平均孔徑為（614.6±214.4）m，較緩釋前增大40.10%±48.87%（＜0.05）；平均孔內(nèi)連接徑為（128.3±38.5） m，較緩釋前增大84.33%±55.32（＜0.05）。載體經(jīng)過長達40周浸泡后，多孔結(jié)構(gòu)孔徑明顯增大，孔內(nèi)連接數(shù)目增多，在相連大孔之間的致密結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)內(nèi)連接孔（見圖4-Bc）。

圖4，-磷酸三鈣載體緩釋實驗前后各部分結(jié)構(gòu)SEM圖。圖A、B分別為緩釋實驗前后載體形貌，圖Aa（×50）、Ba（×30）為多孔結(jié)構(gòu)表面形貌，圖Ab（×30）、Bb（×50）為多孔結(jié)構(gòu)斷面形貌，圖Ac（×1500）、Bc（×1500）為致密結(jié)構(gòu)表面形貌。

2.5 以PBS為介質(zhì)組的利福平體外緩釋結(jié)果

以PBS為介質(zhì)的體外緩釋組，體外緩釋實驗總共進行了40周，清除載體貯藥腔內(nèi)殘留的利福平后干燥稱重，貯藥腔直徑3mm和8mm多孔 -TCP質(zhì)量分別為（3.29±0.02）g、（2.16±0.01）g，其質(zhì)量較緩釋前同比下降（0.06±0.01）g、（0.09±0.01）g（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在體外40周的累積釋藥量分別為（234.87±31.75）mg 、（289.02±38.18）mg（＜0.05），其累積釋藥率（如圖5-D所示）分別為78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）；利福平每2周累積釋藥率如圖5-C所示，單一多孔結(jié)構(gòu) -TCP藥物緩釋系統(tǒng)的釋藥曲線波動較大，尤以貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP為載體的藥物緩釋系統(tǒng)最甚，后期釋藥波動幅度變小，趨勢較平穩(wěn)。在初始的4周，利福平從貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP藥物緩釋系統(tǒng)中每日釋放量見圖 5-A，其累積釋藥量分別為（23.54±3.76）mg、（29.86±4.25）mg（＜0.05），累積釋藥率（見圖5-B）分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%（＜0.05）。

圖5，以PBS為介質(zhì)組的利福平體外緩釋結(jié)果圖。圖A為緩釋實驗初始4周每天釋藥量。圖 B為緩釋實驗初始4周利福平累計釋藥量，利福平從貯藥腔直徑3 mm和8mm多孔 -TCP藥物緩釋系統(tǒng)中累積釋藥率分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%（＜0.05）。圖 C 為40周緩釋實驗利福平每2周累計釋藥率。圖D為40周緩釋實驗利福平累計釋藥率，貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在體外40周的累積釋藥率分別為78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）。

2.6 以CS為介質(zhì)組的利福平體外緩釋結(jié)果

以CS為介質(zhì)的體外緩釋組，總共進行了4周實驗。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP負載利福平后，在體外4 周的累積釋藥量分別為（27.54±2.15）mg、（30.95±2.51）mg（＜0.05），其累積釋藥率（如圖 6所示）分別為12.51%±0.72%、13.65%±0.83%（＜0.05）。

圖6，以CS為介質(zhì)組的利福平體外緩釋結(jié)果圖。

3 討論

在脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)后，單一通過全身運用抗結(jié)核藥物治療往往療效不確切，這是因為抗生素藥物不能真正到達骨感染部位，特別是在病灶清除術(shù)后殘存的壞死或無血管部位。將藥物負載到合適的載體構(gòu)成藥物緩釋系統(tǒng)可以延長藥物療效、減少毒副反應(yīng)、提高生物利用率等[15,16]。 -TCP已在臨床上應(yīng)用于骨組織修復(fù)，其無毒和良好的生物相容性已被廣泛認知[8,10,17,18]，本研究設(shè)計制備的 -TCP載體通過分析SEM圖片得知，多孔結(jié)構(gòu)大孔平均孔徑為（438.7±133.0）m，孔內(nèi)連接徑為（69.6±16.8） m，與設(shè)計初衷的孔徑范圍基本相符。貯藥腔直徑3 mm多孔 -TCP與貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP相比，其縱向壓縮強度增幅達53.52%±7.04%，說明多孔結(jié)構(gòu)能起到一定的力學強度增幅作用，這與較厚的多孔結(jié)構(gòu)含有的致密結(jié)構(gòu)較多有關(guān)。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在PBS中浸泡40周后，其質(zhì)量較緩釋前同比下降（0.06±0.01）g、（0.09±0.01）g（＜0.05），縱向壓縮強度同比下降75.81%±8.06%、73.17%±9.76%（＜0.05），降幅明顯，表明多孔結(jié)構(gòu) -TCP不易長期維持力學強度，容易降解。

本研究將藥物緩釋系統(tǒng)懸吊在液體中，避免了全浸泡放置時載體部分多孔結(jié)構(gòu)與玻璃瓶壁接觸，從而阻礙了利福平的釋放；懸吊后液面距離載體頂端5 mm，而不是全部處于液體內(nèi)，是由于硅膠塞在水平標記線（與液面平齊）之上，從而避免因為硅膠塞封閉不緊密，利福平從硅膠塞與載體縫隙間外漏而干擾實驗結(jié)果。在載體外圍纏繞一圈魚線具有指示載體入水深度的作用，可以隨時觀測每次換液前后載體入水深度是否一致。

以 PBS為介質(zhì)的體外緩釋組，貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP負載利福平后，在體外40周累積釋藥率分別為 78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）。兩種規(guī)格 -TCP載體貯藥腔周邊的多孔結(jié)構(gòu)厚度不同，貯藥腔直徑3mm多孔 -TCP貯藥腔周邊多孔結(jié)構(gòu)厚5.5 mm，貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP載體貯藥腔周邊多孔結(jié)構(gòu)厚3 mm，后者在 PBS中40周累積釋藥率是前者的1.23倍（＜0.05），表明多孔結(jié)構(gòu)能控制利福平釋放速率，多孔結(jié)構(gòu)越厚，其藥物釋放速率越慢。每個 -TCP載體負載0.3 g利福平后，單一多孔結(jié)構(gòu) -TCP藥物緩釋系統(tǒng)釋藥速度較快，其中貯藥腔直徑8mm的藥物緩釋系統(tǒng)在40周的累積釋藥率達96.34%，之后取出載體，發(fā)現(xiàn)在載體貯藥腔內(nèi)有紅褐色的利福平沉積，這可能是因為利福平微溶于PBS，藥物隨時間推移慢慢積聚在一起，類似河床泥沙淤積過程，表明藥物釋放不僅與載體結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與藥物本身的特性相關(guān)。

對于以CS為介質(zhì)組，之所以采取微量換液，是由于動物血清成本較高，但以CS為介質(zhì)組可以與體內(nèi)緩釋過程相對比，故設(shè)計了微量換液的CS介質(zhì)組。在緩釋實驗開始的前4周，在以PBS為介質(zhì)的溶液中，貯藥腔直徑3mm和8 mm多孔-TCP藥物緩釋系統(tǒng)的累積釋藥量分別為（23.54±3.76）mg、（29.86±4.25）mg，累積釋藥率分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%；以 CS為介質(zhì)組的累積釋藥量分別為（27.54±2.15）mg、（30.95±2.51）mg，其累積釋藥率分別為12.51%±0.72%、13.65%±0.83%。兩種規(guī)格 -TCP載體構(gòu)建的藥物緩釋系統(tǒng)以CS為介質(zhì)組其利福平釋放量高于以PBS為介質(zhì)組，這可能與利福平藥物特性有關(guān)，利福平微溶于水、PBS，易溶于有機溶劑，是疏水性物質(zhì)，而動物血清中含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是兩性分子，含有疏水端和親水端，能結(jié)合溶液中的利福平，溶液中游離的利福平減少，使載體內(nèi)外溶液的利福平濃度梯度增大，從而增加利福平的釋放。

影響磷酸鈣載體釋藥的因素主要有被負載藥物的擴散系數(shù)、載體材料孔徑和孔隙率的大小及侵入或包裹載體的物質(zhì)濃度等。藥物的擴散系數(shù)、材料的孔徑和孔隙率越大，侵入或包裹物的濃度越低，藥物釋放越快，反之亦然[19]。韓辰等[20]研究發(fā)現(xiàn)孔隙率可顯著改變 -TCP結(jié)構(gòu)，并影響釋藥速率，有望用于控制載藥 -TCP陶瓷載體的緩釋過程。本文研究表明藥物從緩釋系統(tǒng)中的釋放特性不僅與多孔 -TCP載體的多孔結(jié)構(gòu)厚度有關(guān)，還與藥物本身的特性、洗脫液類型有關(guān)，-TCP多孔結(jié)構(gòu)厚度能有效控制藥物的釋放。保持利福平濃度在（0.005-0.5）g/mL可以殺滅結(jié)核分枝桿菌[21,22]。在本部分體外研究中，多孔 -TCP載體負載利福平后在PBS洗脫介質(zhì)中能夠緩釋長達40周以上，釋藥濃度均在治療濃度之上，有望用于脊柱結(jié)核術(shù)后椎體缺損的治療。