馮言，程安春，劉馬峰

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川 成都 611130

2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 禽病防治中心，四川 成都 611130

3 四川省動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130

鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是屬于黃桿菌科的革蘭氏陰性菌，常引起鴨、鵝、火雞等家禽傳染性的敗血癥及漿膜炎，由于該病的高發(fā)病率與高死亡率，已成為危害各國養(yǎng)鴨業(yè)的主要細菌性傳染病之一[1-3]。鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，目前已經(jīng)鑒定的至少有21種血清型，且各血清型之間無交叉保護作用[4-6]，這就為疫苗防控該病增加了極大困難。且隨著耐藥菌株的逐年增加，使用抗生素防治該病也難以奏效[7-8]。

欲有效防控該病，首先要鑒定該菌的致病因子，進而深入了解該病的發(fā)病機制。目前鑒定的參與鴨疫里默氏桿菌致病的毒力因子有CAMP[9-10]、 sip[11-12]、 TbdR1[13]、 B739_1208[14]等。以上毒力基因的鑒定的方法基于基因缺失，而基因缺失后需要將缺失基因克隆至穿梭質(zhì)粒進行功能回補驗證。在我們之前的研究中，構(gòu)建了能夠用于鴨疫里默氏桿菌基因回補的穿梭質(zhì)粒pLMF03[15]，然而該質(zhì)粒所包含酶切位點較少，接合轉(zhuǎn)移效率低下，不能滿足所有鴨疫里默氏桿菌基因的回補。為解決這一缺陷，本研究構(gòu)建了結(jié)合轉(zhuǎn)移效率高，能穩(wěn)定存在于鴨疫里默氏桿菌中且能用于鴨疫里默氏桿菌基因回補的穿梭質(zhì)粒pFY02。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

質(zhì)粒 pPM5由比利時那慕爾大學(xué) Guy R.Cornelis教授惠贈[16]。質(zhì)粒 pEX18GM 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張立群教授惠贈[17]。質(zhì)粒pLMF03由本實驗室保存；菌株E.coliDH5α、E.coliS17.1、RA ATCC、RA CH-1、RA ATCC ΔtonB2由本實驗室保存；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組 DAN提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB) 公司；DNA連接試劑盒購自Thermo公司；熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB) 購自O(shè)XOID公司；瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司；脫纖維羊血購自鄭州益康生物有限公司；氨芐西林、卡那霉素、頭孢西丁購自上海生物工程有限公司； CaCl2、NaCl、MgSO4均來自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照 GenBank公布的轉(zhuǎn)移位點oriT序列(GenBank Accession No.AAC27024.1)、鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因pRA0726 ori序列(GenBank Accession No.KU997673.1)[18]、高表達啟動子High EXP序列(GenBank Accession No.CP003787.1) 和鴨疫里默氏桿菌tonB2基因序列(GenBank Accession No.RA0C_1209)分別設(shè)計擴增引物oriTP1/P2、pRA0726 oriP1/P2、High EXPP1/P2 和tonB2P1/P2，其中在High EXPP2中加入酶切位點SacⅡ、NheⅠ、StuⅠ、BsshⅡ的序列；分別設(shè)計鴨疫里默氏桿菌單拷貝基因recA(GenBank Accession No.RA0C_RS04870) 和穿梭質(zhì)粒pFY02單拷貝基因cfx(GenBank Accession No.KU997671.1) 的熒光定量PCR引物recAP1/P2和cfxP1/P2(表1)，所有引物由華大基因有限公司合成。

1.3 基因的克隆及回收純化

結(jié)合轉(zhuǎn)移位點oriT的序列是以質(zhì)粒pEX18GM 為模板，oriTP1/P2為引物進行 PCR擴增得到；鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因pRA0726 ori的序列是以質(zhì)粒 pLMF03為模板，pRA0726 oriP1/P2為引物進行PCR擴增得到；高表達啟動子High EXP的序列是以RA CH-1菌株基因組為模板，High EXPP1/P2為引物進行PCR擴增得到；鴨疫里默氏桿菌tonB2基因的序列是以RA ATCC菌株基因組為模板，tonB2P1/P2為引物進行PCR擴增得到。擴增程序為：98 ℃預(yù)變性 30 s；98 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸xs(oriT、pRA0726 ori、High EXP和tonB2基因的延伸時間x分別為30 s，1 min，15 s和30 s)，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；22℃保存。經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確定基因片段擴增正確后，按照北京天根生化科技有限公司DNA純化回收試劑盒操作說明進行PCR產(chǎn)物回收，–20 ℃保存。

1.4 穿梭質(zhì)粒pFY02的構(gòu)建方法

將純化回收的轉(zhuǎn)移位點oriT序列和待改造質(zhì)粒pPM5進行SphⅠ和HindⅢ雙酶切，用DNA純化回收試劑盒回收長片段酶切產(chǎn)物。用 DNA連接試劑盒連接載體片段pPM5與基因片段oriT，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，用加有100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定出陽性克隆(鑒定oriT片段，約800 bp)。用 LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)陽性克隆菌株，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往華大基因有限公司測序，測序無誤后，將新構(gòu)建質(zhì)粒命名為pPM5::oriT。

用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和PstⅠ雙酶切質(zhì)粒

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

pPM5::oriT和鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因pRA0726 ori片段，用上述方法將質(zhì)粒pPM5::oriT和pRA0726 ori基因片段連接，轉(zhuǎn)化及PCR鑒定(鑒定pRA0726 ori片段，約2 000 bp)。質(zhì)粒測序無誤后，將新構(gòu)建質(zhì)粒命名為pFY01。

用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pFY01和高表達啟動子High EXP片段，用上述方法將質(zhì)粒pFY01和High EXP基因片段連接，轉(zhuǎn)化及PCR鑒定(鑒定High EXP片段，約250 bp)。質(zhì)粒測序無誤后，將新構(gòu)建質(zhì)粒命名為pFY02。

1.5 穿梭質(zhì)粒 pFY02在鴨疫里默氏桿菌中的拷貝數(shù)檢測

用TSB培養(yǎng)細菌RA ATCC pFY02至對數(shù)生長期，按照細菌基因組 DNA提取試劑盒說明書提取其總DNA，測其DNA濃度后用去離子水稀釋為 2 ng/μL備用。用鴨疫里默氏桿菌單拷貝基因recA和穿梭質(zhì)粒pFY02上單拷貝基因cfx進行熒光定量PCR對DNA模板量化分析，cfx基因拷貝數(shù)比上recA基因拷貝數(shù)的比值即是穿梭質(zhì)粒pFY02的拷貝數(shù)，具體操作方法參考Lee等[19]。實驗進行3次重復(fù)，取平均值。

1.6 穿梭質(zhì)粒pFY02轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性檢測

首先將構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pFY02轉(zhuǎn)化至E.coliS17.1感受態(tài)細胞中，用加有 100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定出陽性克隆(鑒定oriT與pRA0726 ori總片段，約 2 800 bp)。

本研究使用大腸桿菌(供體菌) -鴨疫里默氏桿菌(受體菌) 結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒 pFY02導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌中，即將E.coliS17.1 pFY02和鴨疫里默氏桿菌RA ATCC11845分別用LB和TSB培養(yǎng)至對數(shù)生長期，7 000 r/min離心10 min，去掉上清，用10 mmol/L的無菌MgSO4分別清洗并重懸菌體，然后按1OD(約2×109CFU) 鴨疫里默氏桿菌和5OD(約2×108CFU) 大腸桿菌的比例混合兩種菌，用孔徑為0.22 μm的滅菌濾膜過濾混合的細菌，將濾膜貼于血平板上，30 ℃培養(yǎng)10–12 h后取出濾膜，用10 mL濃度為10 mmol/L的 MgSO4洗下濾膜上的菌，取 100 μL菌液涂于加有50 μg/mL卡那霉素和1 μg/mL頭孢西丁的血平板上，37 ℃培養(yǎng) 24 h。分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定陽性菌落(鑒定oriT與pRA0726 ori總片段，約 2 800 bp)。將鑒定為陽性的單菌落用血平板傳10代，用PCR的方法鑒定質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

用上述的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將普通的穿梭質(zhì)粒pLMF03和新構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pFY02分別導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌RA ATCC11845。進行結(jié)合轉(zhuǎn)移時，兩組實驗結(jié)合轉(zhuǎn)移過程中使用的大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌數(shù)保持一致，對比兩組實驗結(jié)合轉(zhuǎn)移后長出來的菌落數(shù)并分別數(shù)出平板上的菌落數(shù)，計算出兩種穿梭質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移效率(計算公式：結(jié)合轉(zhuǎn)移后長出來的鴨疫里默氏桿菌數(shù)/結(jié)合轉(zhuǎn)移前加入的鴨疫里默氏桿菌數(shù))。實驗進行3次重復(fù)，取平均值。

1.7 穿梭質(zhì)粒 pFY02在鴨疫里默氏桿菌回補基因能力的檢測

用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pFY02和tonB2片段，按照步驟1.4的方法將tonB2片段克隆到穿梭質(zhì)粒pFY02上，用PCR的方法鑒定陽性克隆(鑒定tonB2片段，約850 bp)。用LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)陽性克隆菌株并用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pFY02::tonB2。 用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒pFY02::tonB2導(dǎo)入RA ATCC ΔtonB2菌株中，分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定回補菌株(鑒定tonB2片段，約850 bp)。

通過檢測生長曲線初步鑒定穿梭質(zhì)粒pFY02的回補能力。在3個均加有20 mL TSB的離心管中分別加入過夜培養(yǎng)的 RA ATCC pFY02、RAATCC ΔtonB2pFY02 及 RA ATCC ΔtonB2pFY02::tonB2菌株，并控制初始OD600為0.1，37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h測一次OD600值，根據(jù)測量不同菌株的OD600值制圖。實驗進行3次重復(fù)，取平均值。

1.8 穿梭質(zhì)粒pFY02回補基因表達量的檢測

用 Western blotting的方法檢測穿梭質(zhì)粒pFY02回補基因的表達能力。用 TSB分別培養(yǎng)RA ATCC pFY02、RA ATCCΔtonB2pFY02 和 RA ATCCΔtonB2pFY02::tonB2至OD600為 1，分別取1 mL上述菌液，12 000 r/min離心2 min，去掉上清后分別用100 μL的蛋白上樣緩沖液重懸，樣品經(jīng)沸水浴 10 min后分別取 10 μL進行SDS-PAGE。電泳完的 PAGE膠經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、蛋白封閉、孵育抗體、顯色后觀察各個菌的TonB2蛋白是否表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭質(zhì)粒pFY02的構(gòu)建

本研究構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒是在質(zhì)粒pPM5的基礎(chǔ)上進行改造的，為了提高其結(jié)合轉(zhuǎn)移效率，我們需要將轉(zhuǎn)移位點oriT序列克隆到此質(zhì)粒中。用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和HindⅢ雙酶切oriT片段和質(zhì)粒pPM5，用DNA連接試劑盒連接載體片段和目的片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞后用加有100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定出陽性克隆(鑒定oriT片段，約800 bp)，結(jié)果見圖 1。提取陽性克隆菌株中的質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往華大基因有限公司測序，測序無誤，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pPM5::oriT。

由于此質(zhì)粒中無鴨疫里默氏桿菌的復(fù)制起始位點，為了使其能夠在鴨疫里默氏桿菌中復(fù)制，本研究將鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因pRA0726ori克隆到此質(zhì)粒中。限制性內(nèi)切酶用SphⅠ和PstⅠ，構(gòu)建方法同上。用PCR鑒定陽性克隆時，鑒定pRA0726 ori片段，約2 000 bp，結(jié)果見圖2。質(zhì)粒測序無誤，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pFY01。

為了方便基因片段插入穿梭質(zhì)粒上且提高基因的表達量，我們將在質(zhì)粒pFY01上克隆一段帶有多個內(nèi)切酶位點的高表達啟動子序列High EXP。限制性內(nèi)切酶用SalⅠ和XbaⅠ，構(gòu)建方法同上。用PCR鑒定克隆中是否含有High EXP片段，約250 bp，結(jié)果見圖3。從陽性克隆中抽提質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，確認(rèn)無誤后將其命名為 pFY02。穿梭質(zhì)粒pFY02構(gòu)建過程示意圖見圖4。

圖1 菌落PCR鑒定E.coli DH5α pPM5::oriTFig.1 Identification of the E.coli DH5α pPM5::oriT strains by PCR.M: DM5000 DNA marker; 1: oriT gene(about 800 bp) was amplified from the plasmid pEX18GM; 2–3: oriT gene was amplified from the individual bacterial colonies of E.coli DH5α pPM5::oriT.

圖2 E.coli DH5α pFY01的菌落PCR鑒定圖Fig.2 Identification of the E.coli DH5α pFY01 strains by PCR.M: DM5000 DNA marker; 1: pRA0726 ori gene(about 2 000 bp) was amplified from the plasmid pLMF03; 2–3: pRA0726 ori gene was amplified from the individual bacterial colonies of E.coli DH5α pFY01.

2.2 穿梭質(zhì)粒 pFY02在鴨疫里默氏桿菌中的拷貝數(shù)測定

使用Lee等[19]的方法，通過熒光定量PCR檢測穿梭質(zhì)粒pFY02在鴨疫里默氏桿菌的質(zhì)粒拷貝數(shù)，實驗進行3次重復(fù)，取平均值，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示cfx基因的拷貝數(shù)比上recA基因的拷貝數(shù)的比值約為26，即穿梭質(zhì)粒pFY02的拷貝數(shù)為26。

2.3 穿梭質(zhì)粒 pFY02結(jié)合轉(zhuǎn)移效率提高且能在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定存在

圖3 E.coli DH5α pFY02的菌落PCR鑒定圖Fig.3 Identification of the E.coli DH5α pFY02 strains by PCR.M: DM5000 DNA marker; 1: High EXP gene(about 250 bp) was amplified from the genome of RA CH-1; 2–3: High EXP gene was amplified from the individual bacterial colonies of E.coli DH5α pFY02.

將穿梭質(zhì)粒pFY02轉(zhuǎn)化至E.coliS17.1中，用PCR的方法鑒定出陽性克隆E.coliS17.1 pFY02(鑒定oriT與pRA0726 ori總片段，約2 800 bp)；通過大腸桿菌(供體菌) -鴨疫里默氏桿菌(受體菌)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒pFY02導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌中，用 PCR的方法鑒定陽性克隆 RA ATCC pFY02(鑒定oriT與pRA0726 ori總片段，約2 800 bp)；將鑒定為陽性的RA ATCC pFY02傳10代，用PCR的方法鑒定質(zhì)粒的穩(wěn)定性(鑒定oriT與pRA0726 ori總片段，約2 800 bp)，結(jié)果見圖6?？梢钥闯鲑|(zhì)粒能穩(wěn)定存在于鴨疫里默氏桿菌中。進行3次重復(fù)實驗，取平均值，計算出普通穿梭質(zhì)粒pLMF03與穿梭質(zhì)粒pFY02結(jié)合轉(zhuǎn)移長出的菌落數(shù)分別約為120個和2 500個(圖7A)。計算出普通穿梭質(zhì)粒pLMF03與穿梭質(zhì)粒pFY02的結(jié)合轉(zhuǎn)移效率分別為 6×10–6和 1.25×10–4(圖 7B)，即穿梭質(zhì)粒 pFY02的結(jié)合轉(zhuǎn)移效率較普通穿梭質(zhì)粒pLMF03高，結(jié)合轉(zhuǎn)移效率提高約21倍。

2.4 穿梭質(zhì)粒 pFY02可用于鴨疫里默氏桿菌基因缺失株的回補

本研究選擇鴨疫里默氏桿菌tonB2基因缺失株來驗證穿梭質(zhì)粒pFY02的基因回補能力。將鴨疫里默氏桿菌的tonB2基因克隆到穿梭質(zhì)粒pFY02中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFY02::tonB2。通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒 pFY02::tonB2導(dǎo)入 RA ATCC ΔtonB2菌株，分離長出的單菌落，用PCR的方法鑒定(鑒定tonB2片段，約850 bp)，結(jié)果見圖8，即回補菌株RA ATCC ΔtonB2pFY02::tonB2構(gòu)建成功。

在3個均加有20 mL TSB的離心管中分別加入過夜培養(yǎng)的 RA ATCC pFY02、RA ATCC ΔtonB2pFY02 和 RA ATCC ΔtonB2pFY02::tonB2，并控制初始OD600為0.1，37 ℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h測一次OD600，根據(jù)測量不同菌株的OD600值制圖。實驗進行3次重復(fù)，取平均值，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示，與RA ATCC野生株相比，tonB2基因缺失株生長明顯受損，然而tonB2基因回補株生長狀態(tài)明顯好于缺失株，說明穿梭質(zhì)粒pFY02具有回補鴨疫里默氏桿菌基因的功能。

圖4 穿梭質(zhì)粒pFY02的構(gòu)建過程示意圖Fig.4 Schematic of the establishment process about shuttle plasmid pFY02.

2.5 穿梭質(zhì)粒 pFY02回補鴨疫里默氏桿菌的基因能穩(wěn)定表達

為了檢測插入穿梭質(zhì)粒pFY02的基因片段在鴨疫里默氏桿菌中的表達能力，使用 Western blotting的方法來檢測RA ATCC pFY02、RA ATCC ΔtonB2pFY02 和 RA ATCC ΔtonB2pFY02::tonB2中的TonB2蛋白水平，TonB2蛋白約42 kDa。結(jié)果見圖10，RA ATCC pFY02和RA ATCC ΔtonB2pFY02::tonB2中TonB2蛋白的水平相似，而tonB2基因缺失株中沒有TonB2蛋白，說明插入穿梭質(zhì)粒pFY02的基因能夠在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定表達。

3 討論

隨著對鴨疫里默氏桿菌研究的深入，基因缺失技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，使缺失基因的功能得到回補成為研究基因功能的必經(jīng)之路。然而目前能用于鴨疫里默氏桿菌基因回補的質(zhì)粒數(shù)量有限，且酶切位點較少，接合轉(zhuǎn)移效率低下，成為鴨疫里默氏桿菌基因功能研究的瓶頸。

圖5 熒光定量 PCR檢測 recA基因和 cfx基因的拷貝數(shù)Fig.5 Identification of the copy number of recA and cfx by real-time qPCR.The error bars represent the standard deviations of three independent experiments(n=3).

圖6 E.coli S17.1 pFY02、RA ATCC pFY02和RA ATCC pFY02傳10代菌落PCR鑒定圖Fig.6 Identification of the E.coli S17.1 pFY02,RA ATCC pFY02 and identification after 10 generations of the RA ATCC pFY02 strains by PCR.M: DM5000 DNA marker; 1: oriT and pRA0726 ori gene(about 2 800 bp) was amplified from the plasmid pFY02; 2: oriT and pRA0726 ori gene was amplified from the individual bacterial colonies of E.coli S17.1 pFY02; 3: oriT and pRA0726 ori gene was amplified from the individual bacterial colonies of RA ATCC pFY02; 4: oriT and pRA0726 ori gene was amplified from the individual bacterial colonies after 10 generations of RA ATCC pFY02.

圖7 穿梭質(zhì)粒pFY02結(jié)合轉(zhuǎn)移效率提高（A：結(jié)合轉(zhuǎn)移后長出的菌落；B：結(jié)合轉(zhuǎn)移效率）Fig.7 The shuttle plasmid pFY02 increased efficiency of conjugal transfer.(A) Growth of the bacterial colony after conjugative transfer.a: growth of the bacterial colony after ueing common shuttle plasmid pLMF03 to conjugative transfer; b: growth of the bacterial colony after ueing efficient shuttle plasmid pFY02 to conjugative transfer.(B)Conjugative transfer efficiency).

由于鴨疫里默氏桿菌的特性，普通質(zhì)粒無法通過電轉(zhuǎn)或者鈣轉(zhuǎn)導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌中，因此需要以大腸桿菌為媒介，通過大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌中。本研究構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pFY02是在質(zhì)粒 pPM5的基礎(chǔ)上進行改造的。為了提高其結(jié)合轉(zhuǎn)移效率，我們將轉(zhuǎn)移位點oriT序列克隆到此質(zhì)粒中；為了使其能夠在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定存在，將鴨疫里默氏桿菌復(fù)制起始基因pRA0726 ori克隆到此質(zhì)粒中；為了方便基因片段插入穿梭質(zhì)粒上且提高基因的表達量，在穿梭質(zhì)粒上克隆一段帶有多個內(nèi)切酶位點的高表達啟動子序列High EXP。最終使該質(zhì)粒能高效地進行結(jié)合轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定存在于鴨疫里默氏桿菌中；此外該質(zhì)粒還能穩(wěn)定地表達回補基因，且其帶有的多個酶切位點更有利于回補基因的克隆。

圖8 RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2的菌落PCR鑒定圖Fig.8 Identification of the RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2 strains by PCR.M: DM5000 DNA marker; 1:tonB2 gene(about 850 bp) was amplified from the genome of RA ATCC11845; 2–3: tonB2 gene was amplified from the individual bacterial colonies of RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2.

圖 9 RA ATCC pFY02、RA ATCC ΔtonB2 pFY02 和RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2在TSB中的生長曲線Fig.9 Growth curves for RA ATCC pFY02,RA ATCC ΔtonB2 pFY02 and RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2 strains in TSB.

圖10 Western blotting檢測RA ATCC pFY02、RA ATCC ΔtonB2 pFY02 和 RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2中的TonB2蛋白Fig.10 The whole-cell extracts from RA ATCC pFY02,RA ATCC ΔtonB2 pFY02 and RA ATCC ΔtonB2 pFY02::tonB2 strains were subjected to Western blotting using an antibody against TonB2.

以前使用的鴨疫里默氏桿菌的穿梭質(zhì)粒pLMF03，其多克隆位點僅有NcoⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ和SpeⅠ四個酶切位點，滿足不了鴨疫里默氏桿菌基因的回補，且酶切位點NcoⅠ的序列是CCATGG，其中存在的起始密碼子ATG可能會引起回補基因的移碼突變，導(dǎo)致回補基因的功能無法正常實現(xiàn)。為了防止回補基因的移碼突變及改善酶切位點少的問題，我們用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XbaⅠ將酶切位點NcoⅠ切除，且在酶切位點XbaⅠ前引進SacⅡ、NheⅠ、StuⅠ和BsshⅡ四個酶切位點，使穿梭質(zhì)粒 pFY02的使用更安全和方便。