影響元寶楓花粉離體萌發(fā)的因素研究

張忠鎮(zhèn)，李岱龍 ，王文文，李 麗

（1.濟(jì)寧林業(yè)局，山東 濟(jì)寧 272019；2.山東永春堂集團(tuán)有限公司）

元寶楓（Acer truncatum Bunge）又稱元寶槭，槭樹(shù)科（Aceraceae）槭屬（Acer）喬木，為我國(guó)特有樹(shù)種，廣泛分布20多個(gè)省區(qū)（中國(guó)植物志,1981）。元寶楓抗寒、抗旱，姿態(tài)優(yōu)美，在園林綠化中多用于行道樹(shù)、孤植樹(shù)。除此之外，元寶楓種子中含油量高達(dá)48%，其中神經(jīng)酸含量超過(guò)5%，且亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸含量超過(guò)58%，可促進(jìn)神經(jīng)纖維修復(fù)和神經(jīng)細(xì)胞再生，對(duì)老年癡呆等病癥效果顯著，種仁蛋白含量27.15%，包含人體所需的8種必需氨基酸，是一種集食用、藥用、保健為一身的新資源樹(shù)種，具有極高的利用價(jià)值和廣泛的開(kāi)發(fā)前景（王性炎和李艷菊,1998）。為了有效開(kāi)發(fā)元寶楓資源，2015年11月國(guó)家林業(yè)局等四部門 《關(guān)于整合和統(tǒng)籌資金支持貧困地區(qū)油茶核桃等木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的指導(dǎo)意見(jiàn)》，把元寶楓列入國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展和重點(diǎn)資金支持的木本油料作物。目前，我國(guó)元寶楓多處于野生狀態(tài)，苗木多采用天然野生的種子繁殖，還沒(méi)有真正意義上優(yōu)良品種，利用天然優(yōu)株進(jìn)行雜交育種的工作亟待開(kāi)展。花粉是植物進(jìn)行有性生殖的雄配子體，雜交育種的成功與否與花粉萌發(fā)活力密切相關(guān)。因此，進(jìn)行元寶楓花粉離體萌發(fā)條件及萌發(fā)特性研究，對(duì)深入開(kāi)展元寶楓育種工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

泗水永春堂集團(tuán)公司8年生元寶楓優(yōu)株，采集將要開(kāi)放的元寶楓花蕾，剝開(kāi)花瓣收集花粉培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 溫度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

將收集的元寶楓花粉均勻撒在2%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上，2 000 Lx的光照強(qiáng)度下分別放在在5、10、15、20、25、30 和 35 ℃的溫度下培養(yǎng) 4 h。

1.2.2 光照對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

將收集的元寶楓花粉均勻撒在2%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上，20℃下分別在光照強(qiáng)度為0、400、800、1200、1600和 2000 Lx下培養(yǎng) 4 h。

1.2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

在20℃，2 000 Lx的培養(yǎng)條件下，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，共9個(gè)組合，分別將三種濃度的蔗糖、H3BO3按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法添加于2%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基中，并調(diào)整不同pH值，培養(yǎng)4 h。

花粉萌發(fā)率用一個(gè)視野中萌發(fā)的花粉數(shù)占總花粉的百分比表示；花粉管長(zhǎng)度用顯微鏡操作軟件中自帶標(biāo)尺測(cè)量。每處理均重復(fù)3次，每個(gè)視野至少觀察30?；ǚ?。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.5處理，LSD顯著性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

表1 溫度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different temperatures on the pollen germination of Acer truncatum

表1顯示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，元寶楓花粉萌發(fā)率先升高后降低，20℃下元寶楓花粉萌發(fā)率最高達(dá)到了92.0%，而25℃時(shí)也達(dá)到了89.9%，均顯著高于與其它培養(yǎng)溫度下的萌發(fā)率（p＜0.05）；溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于元寶楓花粉的萌發(fā)，特別是低于10℃或高于35℃時(shí)的萌發(fā)率均顯著低于其它培養(yǎng)溫度（p＜0.05）。

元寶楓花粉管長(zhǎng)度受溫度影響的變化趨勢(shì)與萌發(fā)率一致，20℃和25℃下培養(yǎng)4 h，花粉管長(zhǎng)度分別達(dá)到了285.3 μm和304.2 μm，平均伸長(zhǎng)速度均大于70 μm·h-1，顯著高于其它溫度下的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度和生長(zhǎng)速度（p＜0.05）。結(jié)果表明，溫度可影響元寶楓花粉萌發(fā)，元寶楓花粉萌發(fā)的最適溫度區(qū)間為20-25℃，過(guò)高或過(guò)低的培養(yǎng)溫度均不利于元寶楓花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)。

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

表2顯示，在黑暗條件下元寶楓萌發(fā)率僅為27.3%，顯著低于有光培養(yǎng)的萌發(fā)率；而光照強(qiáng)度高于1200 Lx時(shí)，元寶楓花粉萌發(fā)率均高于80%，差異不顯著（p＜0.05），其中 1600 Lx下的萌發(fā)率最高達(dá)到88.5%。光照強(qiáng)度低于800 Lx時(shí)，元寶楓花粉管平均長(zhǎng)度為188.4～219.5μm，不同光照強(qiáng)度下無(wú)顯著差異，光照強(qiáng)度高于1200 Lx時(shí)，花粉管長(zhǎng)度均大于 290μm，伸長(zhǎng)速度大于 75 μm·h-1，與低光照強(qiáng)度下的花粉管長(zhǎng)度和伸長(zhǎng)速度差異顯著（p＜0.05）。結(jié)果表明，元寶楓花粉萌發(fā)率和花粉管伸長(zhǎng)速度受光照強(qiáng)度影響，1600～2000 Lx是元寶楓花粉萌發(fā)的最佳光照強(qiáng)度，而低于800 Lx則不利于花粉萌發(fā)。

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響

將培養(yǎng)基成份蔗糖、硼酸及培養(yǎng)基pH值3個(gè)影響元寶楓花粉萌發(fā)特性的因素，按照L9（34）正交設(shè)計(jì)，表3所示為試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)表 3中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，由III型平方和比較可知，對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)率的影響H3BO3＞pH＞蔗糖，最優(yōu)水平組合為A3B1C2， 即 蔗 糖 200 g·L-1、H3BO3100 mg·L-1和pH7.0；對(duì)元寶楓花粉管伸長(zhǎng)的影響H3BO3＞蔗糖＞pH，最有水平組合為A2B1C2，即蔗糖200 g·L-1、H3BO3100 mg·L-1和pH7.0。由此推論3個(gè)因子最佳組合為蔗糖 100 g·L-1、H3BO3100 mg·L-1和 pH5.0～7.0。

表2 光照強(qiáng)度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)的影響Table 2 Effects of light intensity on the pollen germination of Acer truncatum

表3 正交試驗(yàn)對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的影響Table 3 Effect of orthogonal test on pollen germination rate and tube length of Acer truncatum

表4 方差分析主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)Table 4 Variance analysis results

3 討論

花粉活力關(guān)系到植物授精成功與否并影響果實(shí)產(chǎn)量，溫度、濕度、光照、風(fēng)速以及離體時(shí)間等因素與植物花粉活力密切相關(guān)（李訓(xùn)貞 等,2002）。溫度是影響花粉萌發(fā)率的重要因素，過(guò)高或過(guò)低的溫度均可導(dǎo)致花粉的萌發(fā)率下降，這是因?yàn)榛ǚ勖劝l(fā)是一個(gè)復(fù)雜的變化過(guò)程，花粉粒內(nèi)代謝過(guò)程極其旺盛，這些物質(zhì)代謝均需要多種酶的參與，如在絨氈層細(xì)胞分泌的胼胝質(zhì)酶（李寧 等,2008）、花粉萌發(fā)孔發(fā)育相關(guān)的GDSL脂肪酶（辛喜鳳 2012）、糖代謝相關(guān)的酶（林蘇娥 2014）等，而酶的活性對(duì)環(huán)境溫度極其敏感。植物花粉萌發(fā)的最適溫度多集中在20-25℃，當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，可縮短花藥開(kāi)裂時(shí)間，加快花粉失水，導(dǎo)致花粉癟小，萌發(fā)的花粉管變短，花粉活力下降（Weaver和 Timm,1988）。本研究發(fā)現(xiàn)，元寶楓花粉萌發(fā)最適宜的溫度區(qū)間為15～25℃。由于植物長(zhǎng)期適應(yīng)各自分布區(qū)域的氣候特點(diǎn)，其花粉最適萌發(fā)溫度差異明顯（王改萍 等,2009;郭磊 等,2014），即使同一種植物的不同品種間，溫度對(duì)花粉活力的影響也具有較大差異，這與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和種間的適應(yīng)性有關(guān)系（李寧 等,2008）。元寶楓分多分布在我國(guó)北方，花期最溫度一般在15～25℃，這是元寶楓長(zhǎng)期適應(yīng)分布區(qū)的氣候特點(diǎn)的結(jié)果。

目前，光照對(duì)植物花粉活力的影響并無(wú)一致的觀點(diǎn)。彭向永等（2017）發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度可提高蒿柳花粉萌發(fā)率，促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng)；在茉莉（鄧衍明等,2014）、蘭州百合（楊中漢 等,1994）、有斑百合（郭思佳 等,2014）中也發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均與光照強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)素信號(hào)與花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)密切相關(guān)，光照能提高植株溫度，酶活性升高，可刺激植物細(xì)胞鈣離子信號(hào)，鈣和鈣調(diào)蛋白（CaM）與細(xì)胞內(nèi)多種酶（如激活酸性磷酸酯酶Ⅰ）和蛋白結(jié)合后調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)，在花粉管萌發(fā)過(guò)程中CaM的含量高，提高花粉萌發(fā)率，促進(jìn)花粉管的伸長(zhǎng)（Roberts和 Harmon,1992;顧永清 1994）。與以上研究不同，完全黑暗或弱光與光照條件下的金銀忍冬和馬尾松花粉萌發(fā)率無(wú)顯著差異（徐進(jìn) 等,1998;許珂 等 2008）；而對(duì)新疆豬牙花遮陽(yáng)后發(fā)現(xiàn)花粉活力增高，高活力時(shí)間延長(zhǎng)，可延長(zhǎng)授粉時(shí)間和結(jié)實(shí)率（古麗江和古力西拉,2013），棗花粉的萌發(fā)也受到光照的顯著性抑制（吳碩 等,2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度可影響元寶楓花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度，低于1200 Lx不利于花粉萌發(fā)，1600～2000 Lx是元寶楓花粉萌發(fā)的最佳光照強(qiáng)度，本試驗(yàn)未就高于2000 Lx的光照強(qiáng)度對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)情況進(jìn)行研究。光照前度對(duì)不同植物花粉萌發(fā)的結(jié)果不同，可能是植物自身特性以及生長(zhǎng)環(huán)境差異不同導(dǎo)致的。

植物花粉離體培養(yǎng)一般在適宜的環(huán)境下利用液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行，培養(yǎng)基成分和濃度是影響花粉萌發(fā)的關(guān)鍵因素（張紹鈴 等,2005）。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)探討了3種因素在3個(gè)不同水平下對(duì)元寶楓花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的影響，發(fā)現(xiàn)pH 值為 7.0，10%～20%蔗糖、100 mg·L-1的 H3BO3的培養(yǎng)基利于元寶楓花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)。蔗糖除了能夠給花粉萌發(fā)提供能源，也是細(xì)胞中重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，恰當(dāng)?shù)恼崽菨舛瓤杀３只ǚ奂?xì)胞的滲透勢(shì)，防止細(xì)胞吸脹吸水而破裂或失水而質(zhì)壁分離（彭向永 等,2017）。硼酸與花粉對(duì)糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝相關(guān)，能夠促進(jìn)果膠物質(zhì)的合成，利于植物花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)（陳文濤 等,2013），但硼酸濃度升高，反而會(huì)抑制花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)（張紹鈴 等,2005），本試驗(yàn)也得出了相似的結(jié)果。環(huán)境pH值影響花粉萌發(fā)，一般花粉離體培養(yǎng)多為為弱酸性（杜玉虎 等,2006），本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH7.0時(shí)，元寶楓花粉的萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度最高，但由于本試驗(yàn)在正交設(shè)計(jì)時(shí)所設(shè)的pH值間隔偏大，無(wú)法更加精確地判斷影響元寶楓花粉萌發(fā)的最適pH值，這還需要進(jìn)一步細(xì)化研究。

溫度、光照和培養(yǎng)基的成份及濃度均可影響元寶楓花粉離體萌發(fā)，利用單因素和正交試驗(yàn)篩選出的元寶楓最優(yōu)培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)溫度20～25℃，光照強(qiáng)度為1600～2000 Lx，培養(yǎng)基pH值7.0，含有100～200 g·L-1蔗糖和 100 mg·L-1H3BO3。