王 卓，王湛博，程亞楠，尤淋君，楊 勇，王廣基

(1中國藥科大學藥物代謝動力學重點實驗室，南京211198；2南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京210023；3中國藥科大學新藥安全評價研究中心，南京211198)

阿霉素作為臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體腫瘤[1-2]，如白血病、淋巴瘤、胃癌、卵巢癌等，其抗瘤譜廣、抗瘤作用強、療效確切；但同時也會引起心臟毒性、骨髓抑制、脫發(fā)等不良反應，而心臟毒性是其最嚴重的不良反應，因此大大限制了其在臨床上的應用[3-4]。近年來的研究顯示這種心臟毒性可能是由于阿霉素在藥物代謝過程中誘導了活性氧自由基的產(chǎn)生，而后者可通過線粒體依賴性的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導引起心肌細胞凋亡[5-6]。

右丙亞胺是目前市面上唯一一個用于預防蒽環(huán)類心臟毒性的藥品[7]。但其也會導致肝、腎功能功能異常等其他不良反應，此外，有報道稱右丙亞胺會降低蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤藥效，且價格昂貴，故也限制了其在臨床上的使用。

研究表明，五味子乙素作為五味子類中的主要有效成分，可以通過增強心肌抗氧化相關酶活力和上調(diào)谷胱甘肽氧化還原反應循環(huán)系統(tǒng)，及時清除小鼠活性氧的堆積，從而消除對心肌細胞的損傷[8-9]。此外其不良反應小，價格低廉，又能逆轉(zhuǎn)腫瘤對阿霉素的多藥耐藥性。因此，五味子乙素與阿霉素聯(lián)合用藥，可以有效的預防阿霉素誘導的急性心臟毒性，具有很好的臨床應用價值。

聯(lián)合用藥是臨床藥物治療的常用手段，可能會產(chǎn)生藥物之間相互作用，而體外的酶誘導實驗表明，五味子乙素可能存在潛在的肝藥酶誘導和抑制作用[10]。本研究建立優(yōu)化了LC-MS/MS法測定阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇，通過比較SD大鼠單獨給予阿霉素組和聯(lián)合給予五味子乙素和阿霉素組后阿霉素在SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為，初步考察兩者可能存在的藥代動力學相互作用，以期為臨床安全合理用藥提供方法依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

五味子乙素(浙江鼎輝醫(yī)藥科技有限公司)；注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；阿霉素、阿霉素醇對照品(加拿大TRC公司)；柔紅霉素對照品(內(nèi)標，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純(美國Merck公司)，水為自制純化水(美國Millipore公司)，其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

1290超高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國Agilent公司)；API 4000Q-Trap質(zhì)譜儀、AnalystTM色譜工作站(1.6.2版本，美國AB SCIEX公司)；天平(德國Sartorius公司)；離心機(美國Beckman公司)。

1.3 動 物

Sprague Dawley大鼠，體重200 g左右，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 方 法

2.1 溶液的配制

阿霉素儲備液及工作溶液：分別精確稱取兩份適量阿霉素和阿霉素醇，置于試劑瓶中，加入甲醇充分溶解，分別配制成濃度為1.0 mg/mL的阿霉素和阿霉素醇儲備液，各2份，一份作為標準曲線儲備液，一份作為質(zhì)控樣品儲備液。用乙腈-水(1∶1)稀釋至質(zhì)量濃度為10/4、40/16、200/20、400/40、1 000/100、2 000/200、4 000/400和10 000/1 000 ng/mL的阿霉素和阿霉素醇的混合標準曲線工作溶液。同法制備質(zhì)量濃度為10/4、20/8、200/20、1 600/160、8 000/800 ng/mL的阿霉素和阿霉素醇的混合質(zhì)控工作溶液。

內(nèi)標柔紅霉素儲備液及工作溶液：精確稱取適量柔紅霉素，置于試劑瓶中，溶于甲醇中，充分溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標儲備液。用乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為50 ng/mL的內(nèi)標工作溶液。

血漿樣品的制備：取標曲工作溶液10 μL加入空白血漿190 μL得到混合好的標曲樣品，即得血漿濃度為0.500/0.200、2.00/0.800、10.0/1.00、20.0/2.00、50.0/5.00、100/10.0、200/20.0和500/50.0 ng/mL的標準曲線樣品；取質(zhì)控工作溶液20 μL加入空白血漿380 μL得到混合好的質(zhì)控樣品，即得血漿濃度為0.500/0.200、1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL的質(zhì)控樣品。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流動相A為含0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。分析時間為4 min，采用梯度洗脫方式：0～3.5 min，5%～60% B；3.6～4.0 min，5% B。進樣量：10 μL，流速：0.30 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣器溫度：6 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子方式檢測，掃描方式為選擇反應檢測(SRM)；毛細管溫度：320 ℃；噴霧電壓：4 500 V；氣簾氣：25 psi(1 psi=6.895 kPa)；霧化器：45 psi；輔助氣：40 psi；用于定量分析的離子對分別為：m/z544.2→397.3(阿霉素，去簇電壓，80 V，碰撞電壓：15 V)、m/z546.2→399.2(阿霉素醇，去簇電壓，74 V，碰撞電壓：17 V)、m/z528.2→381.2(柔紅霉素，去簇電壓，74 V，碰撞電壓：15 V)。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 μL，加入內(nèi)標工作溶液150 μL；2 000 r/min渦旋5 min使其充分混勻，4 ℃，15 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液100 μL到96孔板中，再加入純水100 μL充分混合搖勻后進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 考察6個不同來源的空白基質(zhì)。雙空白樣品在待測物或內(nèi)標保留時間附近，應不出現(xiàn)顯著干擾。

2.4.2 線性關系 標準曲線將新鮮配制含8個濃度水平的標準曲線樣品(2套)，一套標準曲線樣品在一個分析批的開始時進樣，另一套在結(jié)束時進樣。8個標準曲線樣品濃度分別是：0.500/0.200、2.00/0.800、10.0/1.00、20.0/2.00、50.0/5.00、100/10.0、200/20.0和500/50.0 ng/mL。樣品按照“2.3”項下進行處理，使用權(quán)重因子(1/x2)，通過最小二乘法回歸得到標準曲線的斜率和截距，用于計算被分析物濃度。

2.4.3 精密度和準確度 使用新鮮配制的標準曲線樣品定量新鮮配制的質(zhì)控樣品(0.500/0.200、1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，重復檢測(n=6)，通過計算檢測濃度的變異系數(shù)(%)考察批內(nèi)精密度，計算檢測濃度的平均值和標定濃度的偏差(%)考察批內(nèi)準確度。通過至少2 d，3個不同批次的質(zhì)控樣品并用3套獨立的標準曲線來計算，評估批次間精密度和準確度。每個批次質(zhì)控樣本需要新鮮配制(n=6)，配制濃度與進行批內(nèi)檢測質(zhì)控樣品濃度相同。

2.4.4 基質(zhì)效應 提取至少6份不同來源的SD大鼠血漿的空白基質(zhì)來考察基質(zhì)效應。向空白基質(zhì)樣品添加化合物和內(nèi)標使其最終濃度分別與質(zhì)控樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)的進樣濃度一致；配制含有同樣濃度化合物和內(nèi)標的參比溶液。通過分別比較基質(zhì)樣品和參比溶液中化合物和內(nèi)標峰峰面積計算化合物和內(nèi)標的基質(zhì)效應(MF)。內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應(IS-normalized matrix factor)將通過化合物與內(nèi)標峰面積比來計算基質(zhì)效應。該專題將采用內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應來計算基質(zhì)效應。

2.5 藥代動力學方案

動物試驗部分經(jīng)中國藥科大學新藥安全評價研究中心動物倫理委員會批準。12只雄性SD大鼠，隨機分成兩組。組1(阿霉素組)：靜脈注射5 mg/kg 的阿霉素；組2(五味子乙素+阿霉素組)：連續(xù)灌胃給予五味子乙素20 mg/kg 7 d后，于第7天灌胃給予五味子乙素20 mg/kg后2 h靜脈注射5 mg/kg的阿霉素。采血時間點：分別于給藥前、給藥后5、30 min和1、2、4、6、8、10、24、48、72 h眼眶靜脈叢采血0.3 mL，EDTA-K2抗凝，4 ℃，1 500 r/min離心5 min，分離上層血漿，于-70 ℃冰箱中保存，待測。

3 結(jié) 果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性 本實驗建立了SD大鼠血漿中阿霉素及其代謝產(chǎn)物阿霉素醇的LC-MS/MS檢測方法。如圖1所示，該分析方法具有良好的選擇性，SD大鼠空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾受試物阿霉素和阿霉素醇的測定。

3.1.2 標準曲線 以待測物血漿終濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，進行最小二乘法(權(quán)重系數(shù)為1/x2)回歸計算，求得阿霉素和阿霉素醇在SD大鼠血漿中的線性回歸方程。結(jié)果表明阿霉素在0.5～500 ng/mL，阿霉素醇在0.2～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。本法SD大鼠血漿中阿霉素和阿霉素醇的定量下限(LLOQ)分別為0.5和0.2 ng/mL。

3.1.3 精密度和準確度 質(zhì)控樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00、400/40.0 ng/mL)，每個濃度各制備6個樣進行分析。連續(xù)3個分析批按“2.3”項下方法進行前處理。結(jié)果見表1，該方法測定阿霉素和阿霉素醇的精密度均小于15%，準確度均在(100±15)%以內(nèi)，結(jié)果符合要求。

Figure1 Chromatograms of blank plasma(A) and plasma sample obtained after intravenous injection of doxorubicin(B)

Table1 Inter-and intra-batch precision and accuracy of doxorubicin and doxorubicinol

Analytec/(ng/mL)Accuracy/%Inter-batchIntra-batchRSD/%Inter-batchInter-batchDoxorubicin0.500109.599.611.49.51.00102.5102.67.72.210.095.693.03.73.180.097.093.53.13.840094.192.71.41.5Doxorubicinol0.200112.399.812.011.20.400103.7100.913.83.41.00104.199.86.23.78.00101.2100.73.52.740.098.299.52.72.1

3.1.4 基質(zhì)效應 取6個不同來源的SD大鼠血漿，每個來源的血漿各制備4個濃度的樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，按“2.3”項處理后進樣分析，考察基質(zhì)效應。結(jié)果見表2，阿霉素的基質(zhì)效應在117.7%～131.7%之間，總體變異系數(shù)為5.1%；阿霉素醇的基質(zhì)效應在113.0%～124.2%之間，總體變異系數(shù)為6.6%。阿霉素和阿霉素醇的各濃度水平在SD大鼠血漿中的基質(zhì)效應保持一致。

3.1.4 提取回收率 制備質(zhì)控血漿樣品(1.00/0.400、10.0/1.00、80.0/8.00和400/40.0 ng/mL)，按“2.3”項處理后進樣分析，考察提取回收率。結(jié)果見表2，阿霉素的提取回收率在88.2%～95.7%之間，總體變異系數(shù)為4.1%；阿霉素醇的提取回收率在88.8%～101.1%之間，總體變異系數(shù)為6.2%。阿霉素和阿霉素醇的各濃度水平在SD大鼠血漿中的提取回收率保持一致。

Table2 Matrix effect (ME) and recovery (REC) of doxorubicin and doxorubicinol

Analytec/(ng/mL)Matrix effectME/%RSD/%RecoveryREC/%RSD/%Doxorubicin1.00117.75.195.74.110.0130.388.380.0131.788.5400125.588.2Doxorubicinol0.400115.86.6101.16.21.00113.090.78.00124.289.940.0116.888.8

3.2 藥代動力學結(jié)果

阿霉素單獨靜脈注射和聯(lián)合五味子乙素給藥后，阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇的藥代動力學參數(shù)見表3。利用SPSS 20.0軟件，對兩組血漿中阿霉素和阿霉素醇的藥代動力學參數(shù)分別進行統(tǒng)計分析，AUC0-t、AUC0-∞和cmax經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行獨立樣本t檢驗，對tmax進行非參數(shù)檢驗，其余參數(shù)進行獨立樣本t檢驗，P均大于0.05，結(jié)果見表4。結(jié)果表面阿霉素在單次給藥組和聯(lián)合給藥組中SD大鼠體內(nèi)藥代動力學參數(shù)沒有顯著性差異，聯(lián)合用藥后阿霉素的藥代動力學行為未發(fā)生顯著變化。

Table3 Pharmacokinetic parameters of doxorubicin and doxorubicinol

AnalyteGroupAUC0-t/(ng·h/mL)AUC0-∞/(ng·h/mL)t1/2/hcmax/(ng/mL)DoxorubicinGroup 1605.69±145.84665.77±158.4831.88±17.172 786.00±321.14Group 2564.53±23.99643.39±31.4942.20±9.952 060.00±136.75DoxorubicinolGroup 126.69±13.4149.97±32.5566.64±52.229.69±2.06Group 229.00±2.7854.94±14.3984.79±36.257.25±2.51

Table4 Statistical analysis results of doxorubicin and doxorubicinol

Pharmacokinetic parameterP valueDoxorubicinDoxorubicinolcmax0.1090.119AUC0-t0.1030.500AUC0-∞0.6800.441tmax1.0000.538t1/20.9540.541CL0.7830.382Vd0.2560.146

4 討 論

隨著中藥的廣泛應用，越來越多的患者把中藥補充劑結(jié)合西藥作為治療方案的一部分，中藥-西藥相互作用問題日益凸顯。代謝酶和轉(zhuǎn)運體是影響藥物體內(nèi)處置過程的重要因素，代謝酶承擔藥物的代謝清除，主要包括細胞色素P450超家族(CYP)、UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)以及磺酸化酶(SULT)；轉(zhuǎn)運體參與藥物的口服吸收、體內(nèi)分布以及排泄，主要包括腸道轉(zhuǎn)運體、腎臟轉(zhuǎn)運體、肝臟轉(zhuǎn)運體以及腦轉(zhuǎn)運體等。中藥-西藥的聯(lián)合用藥可能導致代謝酶表達和轉(zhuǎn)運體功能的改變，從而使血漿或特定組織中藥物濃度的變化，進而改變藥物治療效果和安全性，是藥物相互作用的主要靶點。

體外的相互作用研究表明，五味子乙素可能對代謝酶產(chǎn)生誘導和抑制作用。本研究主要采用體內(nèi)手段研究藥物-藥物相互作用，以阿霉素及其主要代謝產(chǎn)物阿霉素醇為研究對象，首先建立了LC-MS/MS法同時檢測SD大鼠血漿中阿霉素和阿霉素醇的檢測方法，并對方法進行了驗證和評估。其次合理安排實驗動物分組，采用經(jīng)過驗證的LC-MS/MS方法對單獨給予阿霉素組和五味子乙素聯(lián)合阿霉素給藥組的SD大鼠藥代動力學行為進行研究，比較兩者的藥代動力學參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素在單次給藥組和聯(lián)合給藥組中SD大鼠體內(nèi)藥代動力學參數(shù)沒有顯著性差異，聯(lián)合用藥后阿霉素的藥代動力學行為未發(fā)生顯著變化。