楊 薇，王紹達(dá)，秦淑杰，吳 綱，何書(shū)英

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的心血管常見(jiàn)疾病，可誘發(fā)腦血管病、冠心病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病[1]。目前認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是由于細(xì)胞因子和血管細(xì)胞間的相互作用，在各種危險(xiǎn)因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷致使多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)的表達(dá)、激活紊亂[2]，并改變平滑肌細(xì)胞基因的表達(dá)致使其異常增殖，從而引起血管腔狹窄和痙攣，使血管局部產(chǎn)生的一種過(guò)度的慢性炎性增生反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中，大量的炎性細(xì)胞因子參與其中，對(duì)AS的發(fā)生和發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用[3]，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血清樣淀粉蛋白P(serum amyloid P，SAP)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(momocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)等。

MAPK和NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)通路中最常見(jiàn)的兩條通路，其關(guān)鍵蛋白被磷酸化激活后可導(dǎo)致通路中的相應(yīng)蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性。在AS病變的早期，NF-κB激活內(nèi)皮細(xì)胞分泌MCP-1和IL-8，介導(dǎo)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向管壁運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[4]。由此可見(jiàn)，抑制促炎性細(xì)胞因子的合成及其相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)是控制AS的有效手段之一。

鹽酸芐絲肼(benserazide hydrochloride)是外周脫羧酶抑制藥，與左旋多巴聯(lián)合應(yīng)用制成復(fù)方制劑多巴絲肼[5]，在臨床上常用于帕金森病的治療。本實(shí)驗(yàn)室前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，鹽酸芐絲肼可顯著降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根、主動(dòng)脈弓的動(dòng)脈斑塊面積，并可顯著下調(diào)與AS相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)(結(jié)果待發(fā)表)。故本研究通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立體外炎癥模型，以進(jìn)一步評(píng)估鹽酸芐絲肼的體外抗炎活性，并探究鹽酸芐絲肼抗動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制。

1 材 料

1.1 試 劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；鹽酸芐絲肼(美國(guó)Alfa Aesar公司，CAS:14919-77-8，AR：98%，批號(hào):C10006404)、LPS(美國(guó)Sigma公司)；四甲基偶氮唑鹽(合肥Biosharp公司)；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL檢測(cè)液試劑盒(博士德生物工程有限公司)；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；人MCP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢六合生物技術(shù)有限公司)；人TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；Trizol溶液(美國(guó)Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄合成一體試劑盒(5×ALL-In-One RT MasterMix)、快速EvaGreen熒光定量PCR預(yù)混試劑盒(EvaGreen 2×qPCR MasterMix)、96孔qPCR板(加拿大ABM公司)；PCR引物(通用生物系統(tǒng)有限公司)；GAPDH抗體(美國(guó)Abways公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(麥約爾生物技術(shù)有限公司)?？筍AP抗體、抗IκBα抗體、抗p-IκBα(phospho S36)抗體、抗p38抗體(英國(guó)Abcam公司)；p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司)；兔抗NFκB p65抗體、兔抗p-NFκB p65(Thr254)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗AKT抗體、抗p-AKT(Ser473)抗體(美國(guó)CST公司)；Lamin b1抗體(美國(guó)Signalway抗體公司)。

1.2 儀 器

TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；Synergy 2型微孔板分析儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、MyCyclerTMThermal Cycler System(美國(guó)Bio-Rad公司)；480Ⅱ型Real-Time qPCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)由中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院徐寒梅教授實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方 法

2.1 藥物配制

鹽酸芐絲肼性質(zhì)極不穩(wěn)定，對(duì)光照、溫度、溶劑的pH變化很敏感，故本實(shí)驗(yàn)采用生理鹽水作為溶劑，配制初始濃度為1×10-7moL/L的鹽酸芐絲肼溶液，在配藥過(guò)程中避光處理，并采用0.22 μm微孔濾器對(duì)藥物進(jìn)行過(guò)濾，于超凈臺(tái)中配制完成后在容器表面包裹錫箔紙并置于4 ℃避光保存。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入0.5%青霉素鏈霉素雙抗溶液，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，傳代周期為2～3 d[6]。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)急性炎癥模型的建立

將HUVECs以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于無(wú)菌6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%細(xì)胞密度時(shí)，將細(xì)胞分為空白組(PBS+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)和模型組、模型組[LPS(300、500、700、900 μg/mL)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。取上清液，離心，并將離心后的細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，于-20 ℃冰箱保存，并用試劑盒檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中TNF-α水平的變化情況。

2.4 MTT測(cè)定鹽酸芐絲肼的細(xì)胞毒性

將HUVECs按每孔1×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白組(0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)、給藥組(0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基+1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L鹽酸芐絲肼)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，溶解結(jié)晶，于水平搖床振蕩混勻10 min后于490 nm處測(cè)定各孔吸收度。

2.5 Western blot和ELISA測(cè)定HUVECs細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平

將HUVECs以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于無(wú)菌6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%細(xì)胞密度時(shí)，將細(xì)胞分為空白組(PBS+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基)、模型組[LPS(500 μg/mL)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，給藥組[LPS(500 μg/mL)+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)+0.5% FBS DMEM培養(yǎng)基]，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。取上清液，離心，并將離心后的細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，于-20 ℃冰箱保存，并用試劑盒檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組中TNF-α和MCP-1水平的變化情況。余下的各組細(xì)胞用胰酶消化后，4 ℃離心收集細(xì)胞沉淀，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，并用Western blot測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組中SAP蛋白的表達(dá)水平。

2.6 qPCR測(cè)定HUVECs細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)水平

將HUVECs以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于無(wú)菌6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)和分組同“2.5”項(xiàng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，每管加入Trizol 1 mL，混勻，靜置10 min后，加入氯仿200 μL，劇烈混勻15 s，室溫靜置5 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上層水相(約500 μL)置于另一EP管中，加異丙醇500 μL，混勻，-20 ℃放置30 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。棄去上清液，加入預(yù)冷75%乙醇(DEPC水配制)1 mL，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，置于超凈臺(tái)室溫干燥3 min，待乙醇揮發(fā)后加入DEPC水20 μL溶解RNA，用Synergy 2型微孔板分析儀測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄合成一體試劑盒說(shuō)明書(shū)將各組分RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃?？焖貳vaGreen熒光定量PCR預(yù)混試劑盒說(shuō)明書(shū)，在96孔qPCR板中依次加入各試劑，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，使用Real-Time qPCR儀檢測(cè)，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃、10 min(預(yù)變性)；95 ℃、15 s(變性)；60 ℃、60 s(退火/延伸)；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。得出各組分的Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2.7 Western blot測(cè)定HUVECs細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平

將HUVECs以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于無(wú)菌6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)和分組同上，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，胰酶消化后4 ℃離心收集細(xì)胞沉淀，再用冷0.01 mol/L PBS洗滌沉淀2遍，每管加入RIPA裂解液(含廣譜蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)150 μL于冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃離心，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，即為細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度并定量，經(jīng)10%或12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉膜2 h，與GAPDH、IκBα、p-IκBα(phospho S36)、p38、p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)、NFκB p65、p-NFκB p65(Thr254)、AKT、p-AKT抗體濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，室溫下TBST洗滌(10 min×4)，室溫山羊抗兔二抗避光孵育1.5 h，TBST洗滌(10 min×3)，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照，并用Image-J進(jìn)行條帶灰度分析。

2.8 核蛋白和胞漿蛋白提取

細(xì)胞處理及分組同上，培養(yǎng)24 h后，取出孔板，棄去上清液，用冷0.01 mol/L PBS洗滌2遍，胰酶消化后4 ℃，1 500 r/min離心3 min收集細(xì)胞沉淀，再用冷0.01 mol/L PBS洗滌沉淀2遍；用移液槍盡可能棄去上清液，勿留殘液，估計(jì)細(xì)胞壓積(離心后的緊實(shí)細(xì)胞體積，約50～100 μL)，使用試劑盒提取核蛋白以及胞漿蛋白，BCA蛋白定量后分裝并保存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 LPS誘導(dǎo)HUVECs炎癥模型的建立

為了確定構(gòu)建HUVECs炎癥模型所需的LPS劑量，將細(xì)胞分為空白組和模型組(分別加入300、500、700、900 μg/mL LPS)，共同孵育24 h后吸取細(xì)胞上清液，通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α水平的變化。如圖1所示，與空白組相比，當(dāng)LPS質(zhì)量濃度在300～500 μg/mL之間時(shí)，TNF-α的表達(dá)量隨著LPS質(zhì)量濃度的升高而升高，當(dāng)LPS質(zhì)量濃度在500～900 μg/mL之間時(shí)，TNF-α的表達(dá)量隨著LPS濃度的升高反而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。綜合數(shù)據(jù)分析結(jié)果，與空白組相比，所有加入LPS的模型組均能刺激細(xì)胞分泌更多的TNF-α，當(dāng)LPS質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞分泌的TNF-α最多，且與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，因此，最終選用500 μg/mL的LPS為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)造模濃度。

3.2 不同濃度鹽酸芐絲肼對(duì)HUVECs的細(xì)胞毒性

不同濃度鹽酸芐絲肼(1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L)作用HUVECs 24 h后，結(jié)果如圖2所示，鹽酸芐絲肼濃度為1×10-7mol/L組與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，而1×10-12mol/L組有極顯著性差異(P<0.01)，除此之外，其余濃度對(duì)HUVECs 的生長(zhǎng)均沒(méi)有顯著影響，因此結(jié)合數(shù)據(jù)分析結(jié)果所呈現(xiàn)的不同濃度鹽酸芐絲肼對(duì)HUVECs生長(zhǎng)影響的穩(wěn)定性，選用1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L 3個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的鹽酸芐絲肼給藥濃度。

*P<0.05vsmodel group (LPS-treated group)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3.3 鹽酸芐絲肼對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中SAP、TNF-α和MCP-1的蛋白和mRNA表達(dá)的影響

在LPS(500 μg/mL)/LPS+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用HUVECs 24 h后，取細(xì)胞上清液，用ELISA檢測(cè)TNF-α和MCP-1的表達(dá)水平，余下的細(xì)胞提取總蛋白后用Western blot檢測(cè)SAP的表達(dá)水平，同時(shí)，用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，通過(guò)qPCR檢測(cè)細(xì)胞SAP、TNF-α和MCP-1 mRNA的表達(dá)水平。如圖3-A所示，與空白組相比，模型組的SAP、TNF-α、MCP-1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；而與模型組相比，給藥組使SAP、TNF-α、MCP-1的表達(dá)水平均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)鹽酸芐絲肼濃度為1×10-9mol/L時(shí)，與模型組相比，SAP、TNF-α減少的量最多且有極顯著性差異(P<0.01)，MCP-1則無(wú)明顯差異；當(dāng)鹽酸芐絲肼濃度為1×10-10mol/L時(shí)，與模型組相比，SAP(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)和MCP-1(P<0.05)均具有顯著性差異；當(dāng)鹽酸芐絲肼濃度為1×10-11mol/L時(shí)，與模型組相比，僅有MCP-1出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，而SAP和TNF-α則無(wú)明顯差異。與此同時(shí)，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對(duì)于SAP和TNF-α表達(dá)的抑制作用具有相似的濃度依賴(lài)性。如圖3-B所示，模型組的SAP(P<0.001)、TNF-α(P<0.05)和MCP-1(P<0.001)mRNA的表達(dá)量相較于空白組均出現(xiàn)了明顯的升高趨勢(shì)，且具有顯著性差異；加入鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用后均使SAP、TNF-α和MCP-1 mRNA的表達(dá)量明顯下降，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.001)。除TNF-α外，給藥組SAP和MCP-1 mRNA的下降趨勢(shì)與其蛋白下降趨勢(shì)相似。圖3的結(jié)果表明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能下調(diào) SAP、TNF-α和MCP-1蛋白及mRNA的表達(dá)。

A:Protein level of SAP,TNF-α and MCP-1 in different groups measured by Western blot and ELISA;B:mRNA level of SAP,TNF-α and MCP-1 in different groups measured by qPCR

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group(LPS-treated group)

3.4 鹽酸芐絲肼對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，在LPS的刺激下，除了IκBα(如圖4-C)，p65、p38、AKT及其磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-AKT和p-IκBα的表達(dá)量有了明顯的上升趨勢(shì)，且均具有顯著性差異(P<0.01/P<0.001/P<0.05)。在不同濃度的鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用下，p65/p-p65、IκBα/p-IκBα、AKT/p-AKT和p-p38表達(dá)水平都受到了不同程度的抑制，且均具有顯著性差異(P<0.01/P<0.001/P<0.05)。當(dāng)鹽酸芐絲肼濃度為1×10-11mol/L時(shí)，相較于模型組，雖然對(duì)p38的表達(dá)有抑制作用而無(wú)顯著性差異，但鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)的這種抑制作用表現(xiàn)出了濃度依賴(lài)性(如圖4-B)。除此之外，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對(duì)p-p65和AKT的表達(dá)也表現(xiàn)出了濃度依賴(lài)性的抑制作用(如圖4-A、D)。信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平在一定程度上可以反映出該條通路的激活程度以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況，圖4所有數(shù)據(jù)表明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)在抑制非磷酸化蛋白p65、p38、IκBα和AKT的表達(dá)的同時(shí)也能顯著抑制其對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-IκBα和p-AKT的表達(dá)，說(shuō)明鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活。

A:Protein level of p65 and p-p65;B:Protein level of p38 and p-p38；C:Protein level of IκBα and p-IκBα；D:Protein level of AKT and p-AKT

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group(LPS-treated group)

3.5 鹽酸芐絲肼對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞信號(hào)通路中p65、p38和IκBα核轉(zhuǎn)位的影響

在LPS(500 μg/mL)/LPS+鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)作用HUVECs 24 h后，用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒分別提取不同實(shí)驗(yàn)組的核蛋白及其對(duì)應(yīng)的胞漿蛋白，BCA定量后用Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)p65、p38以及IκBα的分布情況。如圖5所示，正常情況下，p65、p38及IκBα主要存在于細(xì)胞質(zhì)中；在LPS的刺激下，細(xì)胞迅速做出應(yīng)答，這些因子被迅速激活并轉(zhuǎn)位入核，從而激活與該信號(hào)通路相關(guān)的基因的大量表達(dá)，但加入鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)后，p65、p38及IκBα入核顯著減少，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.01/P<0.001，圖5-A)，由此說(shuō)明，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能明顯抑制 p65、p38及IκBα的核轉(zhuǎn)位。

A:Distribution of p65，p38 and IκBα in nucleus；B:Distribution of p65，p38 and IκBα in cytoplasm

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (LPS-treated group)

4 討 論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分之一，當(dāng)它進(jìn)入機(jī)體時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的激活，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的釋放，是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的最主要的病原分子之一[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，鹽酸芐絲肼可顯著降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根、主動(dòng)脈弓的動(dòng)脈斑塊面積，肝臟SAP的表達(dá)及其在動(dòng)脈內(nèi)膜上的沉積，并可顯著下調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，初步顯示出鹽酸芐絲肼具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛力(結(jié)果待發(fā)表)。在此基礎(chǔ)上，本研究采用LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立體外炎癥模型，以進(jìn)一步評(píng)估鹽酸芐絲肼的體外抗炎活性，并探索其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。

炎癥貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞都會(huì)持續(xù)分泌大量的促炎性細(xì)胞因子，加重受損部位的炎癥反應(yīng)從而加速AS的發(fā)展進(jìn)程，因此檢測(cè)藥物作用后炎癥因子的表達(dá)水平變化對(duì)評(píng)估其抗炎活性有一定意義。綜合Western blot、ELISA以及qPCR的檢測(cè)結(jié)果，可以看出，正常的HUVECs細(xì)胞只分泌少量的炎癥因子，但在LPS的刺激下SAP、TNF-α和MCP-1的表達(dá)量迅速上升，而不同濃度鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對(duì)SAP、TNF-α和MCP-1的蛋白及mRNA的表達(dá)水平均具有顯著抑制作用，說(shuō)明鹽酸芐絲肼具有良好的體外抗炎活性。

MAPK和NF-κB信號(hào)通路是炎癥及炎癥相關(guān)疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化)中發(fā)揮主要作用的兩條信號(hào)通路，已得到廣泛研究。EI Bekay等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK被激活后，可通過(guò)磷酸化或促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、ICAM-1)而活化NF-κB。同樣NF-κB被激活后，也可能通過(guò)其促炎細(xì)胞因子產(chǎn)物反過(guò)來(lái)激活p38 MAPK，NF-κB與p38 MAPK之間形成的相互激活網(wǎng)絡(luò)可以調(diào)控多種炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)AS的發(fā)展進(jìn)程[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)在探索鹽酸芐絲肼抗炎抗動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制時(shí)，首先針對(duì)p38 MAPK和NF-κB這兩條信號(hào)通路進(jìn)行研究。綜合Western blot測(cè)定的鹽酸芐絲肼對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響的所有結(jié)果，可以看出，鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)對(duì)p65、p38、IκBα和AKT的非磷酸化蛋白水平及其對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白水平(即p-p65、p-p38、p-IκBα和p-AKT)均具有明顯的抑制作用，說(shuō)明鹽酸芐絲肼能抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活。

信號(hào)通路被逐級(jí)激活后，通常會(huì)促使該通路中的蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而調(diào)控該通路下游蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄活性。Western blot檢測(cè)到的細(xì)胞核內(nèi)以及胞漿內(nèi)p65、p38和IκBα的分布情況顯示，細(xì)胞在正常狀態(tài)下核內(nèi)僅分布極少量的p65、p38和IκBα，但在LPS的刺激下，這些因子被迅速激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核中，而鹽酸芐絲肼(1×10-9、1×10-10、1×10-11mol/L)能顯著抑制p65、p38、IκBα的核轉(zhuǎn)位。

綜上所述，鹽酸芐絲肼可能通過(guò)抑制AKT/NF-κB通路及p38 MAPK部分通路的激活和核轉(zhuǎn)位來(lái)抑制由其介導(dǎo)的LPS所致HUVECs細(xì)胞中相關(guān)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。