李云莉，高權(quán)新，齊占會，岳彥峰，施兆鴻，彭士明，高 陽

（1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 510300；3．浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，舟山 316022）

我國擁有遼闊的海洋面積，沿海灘涂分布十分廣泛，是全球最大的海水養(yǎng)殖國家，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，品種與產(chǎn)量日益增加，2015年海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達到1 875．6×104t，約占世界海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上，是世界上唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家［1－2］。近年來，隨著我國沿海灘涂總量的增加，沿海灘涂成為了發(fā)展現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的最佳區(qū)域［3］。然而，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖事業(yè)的蓬勃發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)給環(huán)境造成了較大的影響，產(chǎn)生了一系列的環(huán)境問題。造成養(yǎng)殖污染的原因主要有：1）抗生素的使用，2）投入水中的餌料，3）養(yǎng)殖生物的代謝物。其中，抗生素的使用不僅對水體環(huán)境造成污染，而且長期使用抗生素會誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，從而導(dǎo)致無法有效治療致病菌引發(fā)的疾病。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗生素能有效的預(yù)防爆發(fā)性疾病的發(fā)生、促進水生動物的生長以及降低一些營養(yǎng)成分的需求量從而節(jié)約營養(yǎng)成分，但長期使用抗生素會誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生攜帶抗性基因的菌株，特別是會產(chǎn)生具有多重耐藥性的菌株［4］?？股匾坏┻M入水生環(huán)境中，整個水體中的菌落結(jié)構(gòu)將可能發(fā)生改變，這種改變會使水生菌產(chǎn)生抗生素抗性基因，從而對抗生素具有耐受性?？股乜剐曰蚩梢栽诟鞣N環(huán)境介質(zhì)（比如土壤、河水、地下水）中進行遷移、轉(zhuǎn)化，繼而整合到質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動基因元件［5］，之后再進入到微生物環(huán)境中，在細菌之間利用基因的橫向轉(zhuǎn)移進行傳播，使原本沒有抗生素抗性的細菌獲得耐藥性，整個過程伴隨著某些菌的減少，甚至消失［6］；另外，具有耐受性的細菌就會增加，成為優(yōu)勢菌，通過食物鏈進入動物體內(nèi)或人體內(nèi)，嚴重威脅人類健康甚至生命安全。因此，對養(yǎng)殖密集型水域抗生素抗性細菌的多樣性進行即時有效地研究分析是十分必要的。

我國養(yǎng)殖密集水域的底泥是抗生素及其抗性基因的“蓄積池”，其中滋生大量的抗生素抗性細菌，所以本研究將底泥作為研究對象，分別在我國沿海11個典型養(yǎng)殖密集水域采樣，利用DNA提取試劑盒提取底泥樣品中的DNA并將其純化，之后進行高通量測序分析，通過比較不同養(yǎng)殖區(qū)域底泥在不同的抗生素作用下微生物群落的多樣性特征變化，以期掌握當前我國東部沿海養(yǎng)殖密集水域抗生素抗性菌的生物多樣性情況，為后續(xù)有效開展養(yǎng)殖水域的生態(tài)保護及可持續(xù)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

本實驗于2015年9－10月，從中國沿海養(yǎng)殖密集水域采集底泥樣品，從北至南分別是大連、唐山、蓬萊、連云港、啟東、象山、寧德、東山、湛江、陵水和美濟礁等11個地點。各個水域的海水養(yǎng)殖品種不盡相同，山東以北主要養(yǎng)殖半滑舌鰨（Cynoglossus robustus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、對蝦以及海蜇（Rhopilema esculentum）、刺參等；江浙的養(yǎng)殖品種主要是文蛤（Meretrix meretrix）、梭子蟹、對蝦以及大黃魚（Larimichthys crocea）、黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）等；福建以南主要養(yǎng)殖鮑魚、中國花鱸（Lateolabrax maculates）以及珍珠龍膽、點籃子魚（Siganus guttatas）等。每片水域隨機收集10個底泥樣品。底泥樣品用密封袋封好，－80℃保存?zhèn)溆茫?］。

1．2 抗生素抗性菌的篩選

將各地采集到的底泥樣品分別充分混勻后，每份樣品稱取3 g進行平板涂布實驗。實驗采用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其配方為：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 15～20 g，水1000 mL，最終pH為7．4。高溫滅菌后，添加到培養(yǎng)基中的抗生素的濃度分別為：鹽酸四環(huán)素10 μg·mL－1，鹽酸土霉素20μg·mL－1，環(huán)丙沙星2 μg·mL－1，恩諾沙星 2μg·mL－1，磺胺嘧啶 50 μg·mL－1，磺胺甲惡唑 100μg·mL－1。涂布后，36℃培養(yǎng)72 h，每組5個平行。挑選單菌落，分別放入無菌EP管中，并混合。

1．3 抗生素抗性菌的多樣性分析

將經(jīng)抗生素篩選后的細菌樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，在IlluminaMiSeq平臺上對抗生素抗性菌的多樣性進行分析。

1．4 生物信息學(xué)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準確、可靠，先對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)［8］。然后對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進行OTU聚類，利用Greengene數(shù)據(jù)可對物種進行注釋［9］。通過對OTUs進行豐度、Alpha多樣性以及物種在各分類水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計分析，可以得到微生物群落組成［10］，再通過Beta多樣性分析，研究海水養(yǎng)殖水域底泥樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異［11］。

1．5 數(shù)據(jù)分析

利用 Uparse（version 7．1 http：／／qiime．org）軟件平臺進行OTU聚類，采用 RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學(xué)分析；利用Mothur軟件進行稀釋曲線分析；利用Shannon指數(shù)圖和Chao指數(shù)圖進行細菌群落多樣性分析；利用Qiime生成不同分類水平上的多樣品物種分布圖；利用R語言制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 多樣性分析

多樣性指數(shù)是反映豐富度和均勻度的綜合指標，與種類的數(shù)目（即豐富度）和種類中個體分配上的均勻性有關(guān)。Chao指數(shù)可以反映微生物群落的豐富度，而Shannon指數(shù)可以反映微生物群落的多樣性［12］。通過Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)等數(shù)據(jù)進行多樣性分析可知，不同養(yǎng)殖區(qū)域中抗生素抗性菌株的豐富度和多樣性存在著較大的差異，見圖1。由Chao指數(shù)圖可知（圖1-a），大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域抗磺胺甲惡唑的細菌菌群豐富度最高，抗恩諾沙星和環(huán)丙沙星的細菌群落豐富度較低；總體來看，北方海水養(yǎng)殖區(qū)域的細菌菌群比南方海水養(yǎng)殖區(qū)域的細菌菌群豐富度高。由Shannon指數(shù)圖可知（圖1-b），大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域中抗四環(huán)素類和磺胺類抗生素的底泥細菌群落多樣性高于抗喹諾酮類抗生素的底泥細菌群落多樣性，其中尤以抗磺胺嘧啶的細菌群落的多樣性最高。

圖1 不同抗生素作用下各養(yǎng)殖區(qū)域底泥細菌微生物的豐富度Fig．1 Species richness of bacteria in sediments from different culture areas under different antibiotics

2．2 群落結(jié)構(gòu)分析

由圖2可見，海水養(yǎng)殖的底泥中的主要細菌菌群包括酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chiamydiae）、綠彎菌門（Chioroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrycomicrobia）以及分類地位不明確和一些稀有的細菌菌群。其中，在圖2-a中，大部分水域變形菌門占主要優(yōu)勢，其次是厚壁菌門；變形菌門在南方海水養(yǎng)殖海域所占的優(yōu)勢大于北方海水養(yǎng)殖水域所占的優(yōu)勢；采樣點11（美濟礁）的底泥細菌菌群幾乎都是變形菌門。在圖2-b中，大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中，厚壁菌門的細菌群落占主要優(yōu)勢，其次是變形菌門；采樣點11（美濟礁）在磺胺甲惡唑的作用下，變形菌門占主要優(yōu)勢，而在磺胺嘧啶的作用下，厚壁菌門占主要優(yōu)勢。在圖2-c中，大部分海水養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中，厚壁菌門的細菌群落占主要優(yōu)勢，其次是變形菌門；采樣點11（美濟礁）在鹽酸四環(huán)素和鹽酸土霉素的作用下，底泥細菌菌群幾乎都是厚壁菌門。

Heatmap圖通過顏色變化可以直接反映二維矩陣或者表格中的數(shù)據(jù)信息，以數(shù)值的大小來定義顏色的深淺，并將高峰度和低豐度的物種分塊聚類，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣本在分類水平上的群落組成的相似性和差異性［13］。由圖3可見，不同養(yǎng)殖區(qū)域中，各類細菌菌群的豐度在不同抗生素的作用下具有較大的差異，可見養(yǎng)殖區(qū)域中使用抗生素會顯著影響菌落結(jié)構(gòu)。，由圖 3-a可知，在 E8、E4、E9（東山、連云港、湛江水域恩諾沙星抗性菌）組皆具有明顯的優(yōu)勢菌，且優(yōu)勢菌的種類不同，優(yōu)勢菌的種類依次減少；而其它組優(yōu)勢菌的種類和數(shù)量較少；由圖3-b可知，M8（東山水域磺胺甲惡唑抗性菌）、J11（美濟礁水域磺胺嘧啶抗性菌）、J3（蓬萊水域磺胺嘧啶抗性菌）、M3（蓬萊水域磺胺甲惡唑抗性菌）組皆具有明顯的優(yōu)勢菌，且優(yōu)勢菌的種類不同，并依次減少，而其它組則優(yōu)勢菌的種類和數(shù)量皆較少；由圖3-c可知，在T1（大連水域抗鹽酸土霉素）、T4（連云港水域鹽酸土霉素）、S3（蓬萊水域鹽酸四環(huán)素）、S1（大連水域鹽酸四環(huán)素）組具有種類和數(shù)量較多優(yōu)勢菌，且優(yōu)勢菌的種類皆不同，而其它組優(yōu)勢菌的數(shù)量和種類則較少。

3 討論

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了自然界中抗性菌株的數(shù)量劇增，尤其是抗生素抗性致病菌的出現(xiàn)和傳播，嚴重危及人和動物健康。有報道指出，在美國每年有200萬的病例是由抗生素抗性致病菌引發(fā)的，同時導(dǎo)致14 000人死亡［14］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)［15－16］，大量的抗生素抗性菌株源自水產(chǎn)養(yǎng)殖密集水域。海水養(yǎng)殖密集水域的底泥成了抗性基因的蓄積地，并不斷的通過水環(huán)境中的細菌載體，向外周環(huán)境散播［17］。我國是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，抗生素的使用量非常大，尤其是在密集型水域養(yǎng)殖，所以這些水域的菌群結(jié)構(gòu)必然發(fā)生改變，抗生素抗性細菌的比例也會隨之升高［12，18］。眾所周知［19］，水生細菌可以通過移動基因元件的水平移動而獲得耐藥基因，同時細菌的結(jié)構(gòu)組成也在抗生素的自然選擇下發(fā)生動態(tài)變化。然而有關(guān)我國沿海典型養(yǎng)殖水域抗生素抗性菌株的文獻報道較少。

圖2 不同抗生素處理底泥細菌在門水平的相對豐度Fig．2 Relative abundance of bacteria in the level of phylum in seawater treated w ith different antibiotics

圖3 不同抗生素處理海水底泥細菌屬水平菌群分析Fig．3 Bacteria analysis of seawater sediment treated by different antibiotics at the genus level

近年來，隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用量的不斷增加，抗生素的過度使用和處理不當引起了人們的廣泛關(guān)注［20］。濫用抗生素導(dǎo)致藥物的生態(tài)釋放，從而使環(huán)境中的細菌組成向著適應(yīng)抗生素的方向轉(zhuǎn)化［21－22］，抗生素抗性細菌隨之成為優(yōu)勢菌群。早期的研究報道顯示［23－24］，在大海、沿海水域以及海水沉積物中都發(fā)現(xiàn)了抗生素抗性細菌。在自然條件下，水生環(huán)境是抗生素抗性細菌的一個巨大的集聚地［25－26］，越來越多的抗生素抗性菌株在各種水生環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)和鑒定［27－30］。尤其是在養(yǎng)殖密集水域，抗生素通常被混入魚類飼料或是直接加入到養(yǎng)殖水體中，用于預(yù)防和治療水產(chǎn)動物的細菌性疾病，從而加速了抗性基因的傳播和抗性菌株的增殖［17］。所以，隨著養(yǎng)殖水域的富營養(yǎng)化、生物耗氧的增加以及抗生素的大量使用，細菌的多樣性必將發(fā)生顯著變化。然而大海的巨大流動系統(tǒng)也會減緩水產(chǎn)養(yǎng)殖的人為影響。因此，對比分析不同養(yǎng)殖水域細菌多樣性，可初步了解水產(chǎn)養(yǎng)殖活動尤其是抗生素的大量使用對海洋生物群落的影響。在本研究中，通過Chao和Shannon指數(shù)圖分析可知，在不同的養(yǎng)殖區(qū)域中使用同一種抗生素，底泥的細菌群落多樣性存在差異；在同一養(yǎng)殖區(qū)域中使用不同的抗生素，底泥的細菌群落的多樣性也不相同；這說明抗生素的使用顯著改變了細菌的群落組成，這與S?RUM等［31］的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類抗生素抗性菌在我國沿海典型水域中均有分布，而且這些抗生素抗性菌的數(shù)量較大，種類較多，在部分水域優(yōu)勢菌明顯。研究結(jié)果說明這3大類抗生素在我國海水養(yǎng)殖過程中使用普遍，這與實地調(diào)查結(jié)果一致。此外，實驗結(jié)果進一步說明抗生素對水生細菌群落結(jié)構(gòu)具有較大的影響，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗性菌株。喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等抗生素都是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗生素，而且有報道指出這些抗生素的使用可顯著影響水生細菌的多樣性［32－33］。SHAH等［34］對智利鮭魚養(yǎng)殖水域底泥進行了基因分析，發(fā)現(xiàn)海水養(yǎng)殖活動對抗生素抗性菌株的多樣性影響顯著。大量研究證實［34－35］，抗生素在養(yǎng)殖水體和淤泥中的殘留量和時間與抗性基因的含量和抗生素抗性菌株的數(shù)量呈顯著相關(guān)；這些文獻直接或間接指出抗生素對水生細菌的多樣性影響較大，本研究的結(jié)果與之相似。

通過細菌群落門水平分析發(fā)現(xiàn)，本研究選擇的密集養(yǎng)殖水域中變形菌門和厚壁菌門的相對豐度優(yōu)勢明顯。以往的研究指出［36－37］，變形菌門和厚壁菌門是河水、海水以及海洋底泥中的主要類群。在我國渤海和黃海區(qū)域的海水養(yǎng)殖池塘的沉積物中，也發(fā)現(xiàn)主要細菌群落為變形菌門和厚壁菌門［38］。此外亦有研究指出，海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中優(yōu)勢細菌種群中有變形菌門和厚壁菌門［39］。由此可以看出，海水養(yǎng)殖活動對我國密集養(yǎng)殖水域細菌在門水平上的影響較小。然而在屬分類水平上，通過對各樣本進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，添加不同的抗生素會顯著改變細菌群落的多樣性和豐富度；添加同一種抗生素，相鄰水域細菌群落的相似性不高，南、北養(yǎng)殖水域底泥中細菌群落的組成結(jié)構(gòu)存在著較大的差異。究其原因，除了在海水養(yǎng)殖過程中抗生素的使用種類和使用量不同外，可能還由不同海水養(yǎng)殖水域在地區(qū)天氣、養(yǎng)殖模式、溫度變化、水產(chǎn)動物種類等方面的差異造成［40－41］。

綜上所述，喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類抗生素抗性菌我國沿海典型水域分布廣泛；在不同的養(yǎng)殖區(qū)域中使用同一種抗生素，底泥的細菌群落多樣性存在差異；在同一養(yǎng)殖區(qū)域中使用不同的抗生素，底泥的細菌群落的多樣性也不相同；變形菌門和厚壁菌門是養(yǎng)殖水域的主要門類。研究結(jié)果表明，抗生素的使用對抗生素抗性菌的豐度具有顯著的影響，所以規(guī)范抗生素的使用和開展相關(guān)的生態(tài)風(fēng)險評估是今后海洋生態(tài)管理的重點。