大黃活性成分對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎相關(guān)基因蛋白表達(dá)以及炎性因子的影響

姬軍風(fēng) 袁有才 王偉卓

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng)712046)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種炎癥介導(dǎo)的發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、進(jìn)行性的自身免疫性疾病，引發(fā)腦、脊髓髓鞘脫落以及神經(jīng)損傷，多發(fā)于中青年[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，既往研究認(rèn)為抗原特異性T淋巴細(xì)胞被異常激活，可穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致特異性免疫反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘、軸索損傷以及小血管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)MS的產(chǎn)生[2]。隨著診斷、治療技術(shù)的發(fā)展，MS的檢出率逐年升高，復(fù)發(fā)率降低，但MS可引起身體發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的殘疾，這對(duì)MS的診斷和治療提出了巨大的挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)同樣是由于抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，與MS的病理特征相似，因此常用來(lái)作為研究MS的動(dòng)物模型[3，4]。MS的基本病機(jī)是腎虛痰瘀，而大黃酸是具有補(bǔ)瀉作用的大黃活性成分，廣泛應(yīng)用于各種局部或者系統(tǒng)性炎癥的治療。研究表明，大黃酸具有高效的抗炎作用，并且可以阻礙經(jīng)典Th1細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2(Interleukin-2,IL-2)，降低氧化應(yīng)激損傷[5-7]。但關(guān)于大黃酸在MS的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]制備EAE小鼠模型的方法并加以改進(jìn)，采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(Myelin oligodendrocyte glucoprotein,MOG35-55)抗原乳劑免疫C57BL/6小鼠造模，研究EAE小鼠模型的行為學(xué)和IL-2、Foxp3轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3 transcription factor,Foxp3)的水平，旨在探究大黃酸補(bǔ)瀉和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用機(jī)制，為補(bǔ)瀉兼施治療MS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF小鼠(7～10周齡，體重17～23 g)購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；MOG35-55購(gòu)自南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司；完全弗氏佐劑、百日咳毒素、大黃酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IL-2酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒、Foxp3羊抗鼠單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗羊二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckmen公司；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)儀器購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EAE模型的制備 SPF小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在18～25℃、濕度為60%左右的環(huán)境中，自由采食和飲水。無(wú)菌純水將抗原MOG35-55稀釋為10 mg/ml，再加入PBS稀釋為2 mg/ml，與等量的完全弗氏佐劑混合均勻，在冰上制成油包水狀抗原乳劑。對(duì)照組則為等量的完全弗氏佐劑與PBS混合均勻。模型制備前，采用水合氯醛麻醉小鼠，吸取200 μl抗原乳劑分別皮下注射于小鼠背部?jī)蓚?cè)4個(gè)部位，免疫當(dāng)天和48 h后經(jīng)腹腔注射100 μl百日咳毒素。對(duì)照組皮下注射完全弗氏佐劑與PBS混合液，其余處理相同。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、給藥組1、給藥組2、給藥組3，每組18只小鼠。模型制備當(dāng)天給藥組分別腹腔注射大黃酸5、10、20 mg/kg，對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥30 d。

1.2.3EAE模型的評(píng)價(jià) 從免疫當(dāng)天起，觀察小鼠的發(fā)病率、死亡率，并進(jìn)行臨床評(píng)分。按照目前國(guó)際公認(rèn)的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分：正常；1分：鼠尾無(wú)力或張力障礙；2分：?jiǎn)沃糠致楸曰虿綉B(tài)蹣跚；3分：?jiǎn)沃耆楸裕?分：雙肢完全麻痹；5分：瀕臨死亡或死亡。

1.2.4采集樣本 選取EAE模型小鼠以及對(duì)照組第14天、20天、30天處死動(dòng)物，每次取6只小鼠10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射后，將小鼠固定于鼠板上，剪開胸腔，排空血液，取小鼠腦、脊髓，暫放于液氮中保存，隨后置于-80℃冰箱中保存。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2的含量 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2水平的變化，根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀中讀取450 nm波長(zhǎng)的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線找到相應(yīng)濃度。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Foxp3蛋白的表達(dá)量 稱取小鼠腦組織的重量，按照1∶9的比例加入組織裂解液，在組織勻漿器中進(jìn)行3次勻漿，并及時(shí)加入冰水降溫，勻漿結(jié)束后置于冰上孵育20 min，4℃離心，取上清。吸取BCA 工作液A液和B液與蛋白樣品以1∶8 的比例混合，室溫孵育60 min，酶標(biāo)儀上測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白樣品與5×樣品緩沖液混合，調(diào)整蛋白樣品的濃度為4 mg/ml，100℃煮沸變性 5 min。根據(jù)目的蛋白分子量配置12%的分離膠和5%濃縮膠。每孔取20 μg蛋白樣品，設(shè)定濃縮膠電壓為90 V，電泳20 min，分離膠電壓為160 V，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的條帶遷移確定電泳時(shí)間。將提前組裝好的轉(zhuǎn)膜裝置置于電泳槽中，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。將攜帶目的蛋白質(zhì)的膜完全浸沒在3%胎牛血清-TBST溶液中，搖床中室溫封閉30 min。加入采用3%胎牛血清-TBST稀釋的一抗，室溫靜置10 min，4℃過(guò)夜。次日取出膜，室溫靜置30 min，TBST洗膜5次×3 min，加入5%脫脂奶粉-TBST稀釋的二抗，搖床中室溫孵育40 min，TBST洗膜6次×3 min，化學(xué)發(fā)光試劑ECL加入膜上反應(yīng)3～5 min，暗室中曝光10 s～5 min，顯影2 min。以β-actin作為內(nèi)參，分析蛋白質(zhì)的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.2小鼠臨床評(píng)分的變化 對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀，臨床評(píng)分為0；各組小鼠免疫后14～15 d開始發(fā)病，20～25 d達(dá)到高峰期，26～30 d癥狀有所緩解，如表1所示，與模型組相比，給藥組1、給藥組2、給藥組3在第20天(t1=39.250,P1=0.000;t2=34.889,P2=0.000；t3=34.017,P3=0.000 )和30 d(t1=30.889,P1=0.000；t2=21.488,P2=0.000；t3=14.773,P3=0.000 )之間差異顯著；與給藥組1相比，給藥組2、給藥組3在第30天間差異顯著(t1=9.401,P1=0.000；t2=16.116,P2=0.000 )。

2.3小鼠腦組織中細(xì)胞因子IL-2的變化 結(jié)果如表2所示，模型組腦組織中IL-2的表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均顯著高于對(duì)照組(t1=25.948,P1=0.000；t2=44.002,P2=0.000；t3=23.702,P3=0.000 )；給藥組1、給藥組2、給藥組3在第20天(t1=7.508,P1=0.000；t2=22.724,P2=0.000；t3=21.391,P3=0.000 )和第30天(t1=7.709,P1=0.000；t2=11.655,P2=0.000；t3=14.395,P3=0.000 )腦組織中IL-2的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，顯著低于模型組；與給藥組1相比，給藥組2、給藥組3在第20天(t1=15.217,P1=0.000；t2=13.884,P2=0.000 )和第30天(t1=3.946,P1=0.000；t2=6.686,P2=0.000 )顯著升高。

2.4小鼠脊髓組織中細(xì)胞因子IL-2的變化 結(jié)果如表3所示，模型組脊髓組織中IL-2的表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均顯著高于對(duì)照組(t1=15.188,P1=0.000；t2=41.499,P2=0.000；t3=32.890,P3=0.000 )；給藥組1、給藥組2、給藥組3在第14天(t1=9.837,P1=0.000；t2=11.912,P2=0.000；t3=13.348,P3=0.000)、第20天(t1=23.453,P1=0.000；t2=32.544,P2=0.000；t3=33.139,P3=0.000 )和第30天(t1=14.668,P1=0.000；t2=21.647,P2=0.000；t3=23.679,P3=0.000 )脊髓組織中IL-2的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，在第20天和第30天顯著低于模型組；與給藥組1相比，給藥組2、給藥組3在第20天(t1=9.091,P1=0.000；t2=9.686,P2=0.000 )和第30天(t1=6.979,P1=0.000；t2=9.011,P2=0.000 ) IL-2表達(dá)水平顯著升高。

Groups14 d20 d30 dModel group0.35±0.063.50±0.231.70±0.15Administration group 10.33±0.091.25±0.141)0.55±0.091)Administration group 20.18±0.061)1.50±0.171)0.90±0.071)2)Administration group 30.23±0.081)1.55±0.131)1.15±0.121)2)F21.760660.355337.876P0.0000.0000.000

Note：Compared with the model group,1)P<0.05;compared with the administration group 1,2)P<0.05.

2.5小鼠Foxp3蛋白的表達(dá)量變化 結(jié)果如表4、圖1所示，模型組腦組織中Foxp3蛋白的表達(dá)量在第20天、第30天均顯著低于對(duì)照組(t1=2.429,P1=0.017；t2=19.536,P2=0.000；t3=15.276,P3=0.000 )；給藥組2(t1=9.768,P1=0.000；t2=6.018,

Groups14 d(pg/ml)20 d(pg/ml)30 d(pg/ml)Control group32.23±1.2534.26±1.8534.38±2.32Model group49.86±2.351)69.25±1.261)52.46±2.161)Administration group 135.26±1.522)40.23±2.421)2)40.26±1.692)Administration group 234.27±2.362)52.33±3.141)2)3)43.27±2.481)2)3)Administration group 334.53±2.412)51.27±2.781)2)3)45.36±2.671)2)3)F221.446568.847151.962P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05；compared with the administration group 1,3)P<0.05.

Groups14 d(pg/ml)20 d(pg/ml)30 d(pg/ml)Control group63.25±3.3565.24±4.2662.48±3.64Model group78.69±2.631)120.34±5.251)98.58±4.251)Administration group 173.25±2.361)96.38±3.411)2)78.58±2.632)Administration group 275.36±3.281)108.45±3.231)2)3)86.24±2.501)2)3)Administration group 376.82±3.471)109.24±3.401)2)3)88.47±3.121)2)3)F70.894508.202300.345P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05；compared with the administration group 1,3)P<0.05.

Groups14 d20 d30 dControl group0.83±0.050.84±0.070.85±0.08Model group0.79±0.060.42±0.071)0.52±0.071)Administration group 10.76±0.040.82±0.062)0.83±0.062)Administration group 20.78±0.030.63±0.051)2)3)0.72±0.061)2)3)Administration group 30.77±0.060.65±0.071)2)3)0.75±0.051)2)3)F5.385125.35173.843P0.0010.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05；compared with the administration group 1,3)P<0.05.

圖1 小鼠腦組織中Foxp3蛋白的表達(dá)量變化Fig.1 Changes of Foxp3 protein level in brain tissue of mice

P2=0.000)、給藥組3(t1=8.838,P1=0.000；t2=4.629,P2=0.000 )在第20天和第30天腦組織中Foxp3蛋白的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，顯著高于模型組；與給藥組1相比，給藥組2、給藥組3在第20天(t1=8.838,P1=0.000；t2=7.907,P2=0.000 )和第30天(t1=5.092,P1=0.000；t2=3.703,P2=0.000 ) Foxp3蛋白的表達(dá)量顯著降低。

3 討論

EAE是敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的自身免疫性疾病，以中樞神經(jīng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘為特征，與人類多發(fā)性硬化的病理癥狀極為相似，因此常被用于研究多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制和治療方案的動(dòng)物模型。EAE通過(guò)在敏感動(dòng)物體內(nèi)注射特異性的抗原與完全弗氏佐劑混合液主動(dòng)免疫誘導(dǎo)，或轉(zhuǎn)移致敏性髓鞘成分的肽段的CD4+T淋巴細(xì)胞過(guò)繼免疫誘導(dǎo)。MOG35-55抗原乳劑免疫C57BL/6小鼠誘導(dǎo)EAE的產(chǎn)生，其病理?yè)p傷與MS極為相似。MOG是一種由少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘膜分泌的跨膜糖蛋白，細(xì)胞膜外區(qū)域含有3個(gè)致腦炎抗原決定簇，其中MOG35-55多肽是MOG蛋白胞外區(qū)最外邊的致腦炎抗原決定簇，極易受到攻擊。實(shí)驗(yàn)證明，MOG是目前唯一的既能誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)又能促進(jìn)脫髓鞘抗體反應(yīng)的蛋白[9]，因此被廣泛應(yīng)用于致腦炎性髓鞘動(dòng)物模型中。C57BL/6小鼠遺傳背景清晰，繁殖能力較強(qiáng)，因此常被用于研究基因工程等領(lǐng)域的動(dòng)物模型。

大黃是一種臨床常用藥，具有退熱、瀉下、抗炎作用，其活性成分之一是大黃酸，是廣為人知的局部和系統(tǒng)抗菌類藥物。研究顯示大黃酸同樣具有顯著的抗菌作用，可阻礙經(jīng)典Th1細(xì)胞分泌抗炎相關(guān)因子[10]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大黃酸可抑制相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)從而阻礙炎癥信號(hào)通路的傳播，降低下游靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[11]。研究證明，大黃酸由于微環(huán)境的差異，在脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞的不同時(shí)期既表現(xiàn)出抗炎的作用又發(fā)揮促炎作用[12]。在本研究中，給予EAE小鼠模型不同劑量的大黃酸可有效降低小鼠的發(fā)病率；臨床評(píng)分結(jié)果顯示模型組小鼠的評(píng)分顯著高于給予不同劑量的大黃酸的小鼠，其中給予5 mg/kg大黃酸的EAE小鼠評(píng)分顯著降低，提示大黃酸對(duì)EAE小鼠具有顯著治療效果，其中小劑量治療作用最佳。

Th0是一種未完全分化的細(xì)胞，其分化受細(xì)胞局部微環(huán)境細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[13]。IL-12和干擾素γ因子可促進(jìn)Th0細(xì)胞分化形成Th1細(xì)胞，分泌Th1型細(xì)胞因子比如IL-2和腫瘤壞死因子β，主要參與細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用、細(xì)胞毒功能等[14,15]。其中IL-2還可刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化。Foxp3是調(diào)控Treg細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因素[16]。研究表明，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)Foxp3可引起Treg免疫抑制反應(yīng)，表明Foxp3是免疫抑制反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)基因[17,18]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠在第20天和第30天腦、脊髓組織中分泌的IL-2顯著增加，腦組織中Foxp3表達(dá)量顯著降低；給予不同劑量的大黃酸可降低EAE小鼠腦、脊髓組織中的IL-2水平，上調(diào)Foxp3表達(dá)量，小劑量的作用效果相對(duì)顯著，提示小劑量大黃酸可能通過(guò)抑制IL-2水平和促進(jìn)Foxp3表達(dá)量，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的功能。

綜上所述，小劑量大黃酸對(duì)EAE小鼠的治療效果最佳，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制IL-2水平、促進(jìn)Foxp3表達(dá)量，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫功能，為MS的治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。