PADI4-siRNA-MSN的構(gòu)建及其在RA防治中的初步應(yīng)用①

陳賽閣 成 宇 宗 明 范列英

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200120)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種影響關(guān)節(jié)、結(jié)締組織、肌肉、肌腱和纖維組織的慢性自身免疫性疾病。它主要的特征是炎癥引起的運(yùn)動(dòng)障礙、進(jìn)行性殘疾和系統(tǒng)性并發(fā)癥。RA影響全世界0.3%～1%的人群，特別是婦女、吸煙者和老年人[1]。患者表現(xiàn)出相當(dāng)高的致殘率，給患者及社會(huì)帶來很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其致病機(jī)制還不明確，許多類型細(xì)胞都參與其中，已確認(rèn)在RA發(fā)病機(jī)制中關(guān)節(jié)滑膜的成纖維樣細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)發(fā)揮著重要的作用[2]。研究表明PADI4與RA的發(fā)病機(jī)制及易感性、基因調(diào)控、細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，RA-FLS是PADI4的主要來源，與正?；そM織相比，RA患者的PADI4表達(dá)量特異性增高[3]。本課題組前期研究用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA干擾PADI4表達(dá)后RA-FLS的凋亡增加，證實(shí)了PADI4通過影響FLS的凋亡在RA的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。

近年來，siRNA在疾病治療研究中展示了誘人的應(yīng)用前景，然而，仍有“脫靶”效應(yīng)、免疫系統(tǒng)激活、內(nèi)源性RNA競(jìng)爭(zhēng)和遞送相關(guān)各種障礙，如半衰期短，生物分布及靶向性，細(xì)胞攝取等諸多因素限制siRNA在臨床上的應(yīng)用[5]。在本研究中，采用模板法合成MSN[6]，包被RhB、PEI后包載siRNA，構(gòu)建PADI4-siRNA-MSN，可以克服傳統(tǒng)脂質(zhì)體使用的缺點(diǎn)，更精確、高效率地介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染，觀察PADI4表達(dá)和RA-FLS細(xì)胞凋亡的變化，為MSN在RA防治中的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 RA-FLS原代細(xì)胞來自同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，從確診的進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中分離得到。所有患者均簽署知情同意書，診斷均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB)、原硅酸乙酯(Tetraethylorthosilicate，TEOS)、1,2-二(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(1,2-Bis(Triethoxysilyl)ethane，BTEE)、三乙醇胺(Triethanolamine，TEA)、水楊酸鈉(Sodium salicylate，NaSal)、聚乙烯亞胺溶液(Polyethyleneimine，PEI)、羅丹明B(RhB，分析純)均購(gòu)自Sigma。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。siRNA由上海吉瑪基因合成。RNA逆轉(zhuǎn)錄采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑(Promega公司)。定量PCR反應(yīng)使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa公司)。定量PCR引物由Invitrogen公司合成。AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。siRNA序列設(shè)計(jì)：合成2組FAM標(biāo)記的siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，分別是：siRNA-1225：正義序列：5′-GGGUAUCAGUGGACUGGACUCCUUU-3′；反義序列：5′-AAAGCAGU-CCAGUCCACUGAUACCC-3′。siRNA-944：正義序列：5′-CAGGAGGUGUACGCGUGCAGUAUUU-3′；反義序列：5′-AAAUACUGCACGCGUACACCUCCUG-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI 7500公司，電泳儀及電泳槽購(gòu)自Tanon公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad Model 680，磁力攪拌器購(gòu)自IKA公司，多功能真空干燥離心機(jī)購(gòu)自基因有限公司，數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，液相超聲波儀購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，透射式電子顯微鏡購(gòu)自日本電子公司，激光粒徑分析儀購(gòu)自Malvern公司，正置熒光顯微鏡購(gòu)自Leica公司。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1MSN的制備及表征檢測(cè) 0.068 g催化劑TEA加入25 ml蒸餾水中，80℃下溫和攪拌30 min；加入結(jié)構(gòu)導(dǎo)向試劑CTAB 380 mg和NaSal 168 mg繼續(xù)攪拌1 h；加入前驅(qū)體4 ml TEOS和1.6 ml BTEE，溫和攪拌2 h；離心提純，乙醇沖洗數(shù)次；用甲醇和HCl抽提收集到的產(chǎn)物(其中每1 g白色粉末加入100 ml甲醇和6 ml濃鹽酸)，60℃下6 h，3次，用于去除模板；室溫真空干燥5 h得到白色粉末狀物質(zhì)，即為MSN[6]。取適量納米粒子，加乙醇溶液，經(jīng)超聲后，用激光粒徑分析儀檢測(cè)其粒徑及Zeta電勢(shì)，用透射電子顯微鏡(Transmission electron microsc-ope，TEM)觀察其形貌特征。

納米粒子表面包被RhB：1.0 g MSN加入100 ml去離子水中，加入100 mg羅丹明B，避光攪拌 24 h，得到的懸濁液離心，用蒸餾水洗滌，以除去吸附在MSN外表面的RhB，離心分離，室溫干燥12 h，得到RhB-MSN[7]。取適量納米粒子乙醇混懸液，用熒光顯微鏡觀察其熒光強(qiáng)度。

納米粒子表面包被PEI：將RhB-MSN懸浮于PEI的乙醇溶液中(5 mg納米粒子加2.5 mg PEI)，經(jīng)超聲處理及干燥，重復(fù)2次，然后在乙醇中洗滌去除未結(jié)合的PEI，后經(jīng)真空干燥得到PEI修飾的RhB-MSN(RhB-MSN-PEI,下文統(tǒng)簡(jiǎn)稱MSN)[7]。取適量納米粒子乙醇混懸液，用激光粒徑分析儀檢測(cè)其粒徑及Zeta電勢(shì)。

1.2.2RA-FLS細(xì)胞培養(yǎng) RA-FLS的培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞轉(zhuǎn)種至6孔板，分別設(shè)立陰性對(duì)照組(si-NC)、siRNA(si-944和si-1225)干擾組。將siRNA、MSN與水的混合物4℃搖床避光過夜?；旌衔镏蠱SN、siRNA和水的比分別是7∶1∶2，之后得到PADI4-siRNA-MSN， 將100 μl PADI4-siRNA-MSN加入6孔板中在37℃，5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4轉(zhuǎn)染率 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS 10 h后，收集細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RhB、FAM熒光強(qiáng)度，鑒定PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染率。

1.2.5熒光定量PCR檢測(cè)PADI4 mRNA水平 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS 48 h后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)PADI4基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)基因?qū)Ｒ恍砸?。PADI4正向引物：5′-TTCTCTAAGGCGGAAGCTTTT-3′；反向引物：5′-AGCAGGGAACACACCTTCTC-3′。GAPDH正向引物：5′-ACCATGGGGAAGGTGAAG-3′；反向引物：5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′。按照SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書配制20 μl反應(yīng)體系，在全自動(dòng)PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃變性30 s，95℃5 s，60℃ 34 s，二步法擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，另外溶解曲線分析采用95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s，解離時(shí)間為4 s。PADI4相對(duì)表達(dá)量(PADI4 mRNA水平)：2-ΔΔCt，ΔCt=CtPADI4-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt參考樣本。

1.2.6蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白量表達(dá)變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染PADI4-siRNA-MSN 48 h后加入適量十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解液(碧云天生產(chǎn))提取蛋白質(zhì)，經(jīng)過蛋白定量后，用蛋白印跡法檢測(cè)各組PADI4蛋白表達(dá)。

1.2.7Annexin V-APC/7-AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS 48 h后，收集細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-APC/7-AAD雙染法說明書處理樣本，避光染色15 min，F(xiàn)CM檢測(cè)各期細(xì)胞。

1.2.8PADI4-siRNA-MSN胞內(nèi)分布 將細(xì)胞接種至鋪有蓋玻片的12孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入PADI4-siRNA-MSN，37℃，5%CO2培養(yǎng)10 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加1 ml 4%多聚甲醛溶液，4℃避光固定20 min，吸棄固定液，PBS洗滌3次，加1 ml DAPI，室溫避光染色10 min，吸棄染液，PBS洗滌3次，小心取出蓋玻片，封片劑封片，CLSM觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1MSN相關(guān)表征 TEM結(jié)果(圖1A、B)顯示MSN已成功制備，熒光顯微鏡結(jié)果(圖1C、D)顯示成功包被熒光分子RhB。激光粒徑分析儀結(jié)果(表1)顯示經(jīng)過PEI修飾后納米粒子粒徑明顯減小，表面正電荷密度增加，證明陽(yáng)離子聚合物PEI已成功包被。

2.2PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染率檢測(cè) PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS細(xì)胞10 h后，收集細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RhB、FAM熒光強(qiáng)度，顯示si-944、si-1225轉(zhuǎn)染率分別為93.3(74.8±18.5)% 和91.9(76.7±15.2)%(圖2B)。

圖1 TEM觀察的MSN形貌及熒光顯微鏡觀察RhB-MSN熒光標(biāo)記Fig.1 TEM images of synthesized MSN and fluorescent label of RhB-MSNNote: A.×30；B.×100；C.Bright field；D.Green light.

表1激光粒徑分析儀檢測(cè)MSN表征

Tab.1MSNcharacterizationdeterminedbydynamiclightscattering

FormulationSize(nm)Zeta potential(mV)MSN654+3.02MSN-PEI270+37.6

2.3鏡下觀察PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染后RA-FLS生長(zhǎng)狀況 分別觀察PADI4-siRNA-MSN處理24、48、72 h后的RA-FLS，鏡下觀察凋亡細(xì)胞特征是：失去細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞皺縮，體積明顯變小成點(diǎn)狀，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(si-NC組)相比，siRNA處理組(si-944、si-1225組)細(xì)胞凋亡明顯增多(圖3)。

2.4PADI4-siRNA-MSN對(duì)RA-FLS細(xì)胞中PADI4 mRNA表達(dá)水平的影響 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS細(xì)胞48 h后，提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FLS中PADI4 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，si-NC組中的PADI4 mRNA水平為1.23±0.27；si-944、si-1225干擾組中PADI4 mRNA水平分別為0.35±0.12、0.44±0.12，表明PADI4-siRNA-MSN成功干擾RA-FLS細(xì)胞中PADI4 mRNA表達(dá)，siRNA干擾組PADI4 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2和圖4A。

圖2 FCM檢測(cè)RA-FLS細(xì)胞中PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染率Fig.2 Cellular uptake of PADI4-siRNA-MSN determined by FCMNote: AS.si-944;B.si-1225.

圖3 鏡下觀察PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后RA-FLS生長(zhǎng)情況Fig.3 After transfection with PADI4-siRNA-MSN for 24 h,48 h,72 h,growth of RA-FLS observed by microscope

2.5PADI4-siRNA-MSN對(duì)RA-FLS細(xì)胞中PADI4蛋白表達(dá)水平的影響 轉(zhuǎn)染2對(duì)PADI4 siRNA 48 h后，提取蛋白質(zhì)，采用蛋白印跡法檢測(cè)各組PADI4蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)選取的2對(duì)PADI4 siRNA均能在蛋白質(zhì)水平抑制PADI4的表達(dá)，見圖4B，表明PADI4-siRNA-MSN成功發(fā)揮沉默效應(yīng)，抑制PADI4蛋白的表達(dá)。

2.6PADI4-siRNA-MSN對(duì)RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，Annexin V-APC/7-AAD雙染色后，F(xiàn)CM分析細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，siRNA干擾組凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，與si-NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染后72 h和48 h凋亡結(jié)果相比，死細(xì)胞明顯增多，見表3和圖5。表明PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS，顯著增加FLS細(xì)胞凋亡。

2.7PADI4-siRNA-MSN胞內(nèi)分布 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS 10 h后，蓋玻片染色，采用CLSM觀察并拍照，結(jié)果顯示PADI4-siRNA-MSN分布在核周，見圖6。

表2PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS48h后，RA-FLS中PADI4基因水平表達(dá)的變化

Tab.2ExpressionofPADI4inRA-FLSafterincubationwithPADI4-siRNA-MSNfor48h

GroupsPADI4 mRNA levelx±stPsi-NC+MSN1.23±0.27-si-944+MSN0.35±0.125.210.051)si-1225+MSN0.43±0.124.680.051)

Note：Compared with si-NC+MSN.

圖4 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染RA-FLS 48 h后，RA-FLS中PADI4基因水平及蛋白水平表達(dá)的變化Fig.4 Expression of PADI4 in RA-FLS after incubation with PADI4-siRNA-MSN for 48 hNote: Compared with si-NC+MSN，*.P<0.05.

表3FCM檢測(cè)PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染對(duì)RA-FLS凋亡的影響

Tab.3ApoptosisofRA-FLSafterincubationwithPADI4-siRNA-MSNfor48hPADI4-siRNA-MSNfor48h

GroupsApoptosis cells(%)x±stPsi-NC+MSN8.83±0.15-si-944+MSN11.70±0.82-5.963<0.011)si-1225+MSN13.00±1.42-5.061<0.011)

Note: Compared with si-NC+MSN.

圖5 FCM檢測(cè)PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染對(duì)RA-FLS凋亡的影響Fig.5 Apoptosis of RA-FLS after incubation with PADI4-siRNA-MSN for 48 hNote: Compared with si-NC+MSN.*.P<0.05.

圖6 PADI4-siRNA-MSN轉(zhuǎn)染FLS 10 h后CLSM結(jié)果Fig.6 CLSM images of RA-FLS after incubation with PADI4-siRNA-MSN for 10 hNote: A.Merged confocal images of RhB(red),DAPI(blue)and FAM(green)；B.Magnification of cell from center of A.PADI4-siRNA-MSN shows expected perinuclear localization;C.DAPI-stained nucleus；D.FAM-labeled siRNA；E.RhB-labeled MSN.

3 討論

RA是一種常見的自身免疫病，我國(guó)發(fā)病率約為0.3%～0.5%，是造成人群勞動(dòng)力喪失和致殘的主要疾病之一。RA病因復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境、感染和體內(nèi)激素水平等因素有關(guān)[8]。RA的基本病理改變是持久反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)滑膜慢性增生性非化膿性炎癥，侵入滑膜下軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[9,10]。正常關(guān)節(jié)滑膜的滑膜內(nèi)層主要有巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和成纖維滑膜細(xì)胞(FLS)組成，生理情況下約70%～80%的滑膜細(xì)胞為FLS。在RA中，關(guān)節(jié)滑膜在慢性、持續(xù)性炎癥過程中引起FLS表型和功能發(fā)生根本性變化，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的FLS被激活，F(xiàn)LS增生活躍、細(xì)胞數(shù)量顯著增加導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)滑膜增厚[11]。肽?；彼崦搧啺访?(PADI4)是PADI家族的成員之一，可以在瓜氨酸化過程中將肽酰基精氨酸殘基轉(zhuǎn)換為瓜氨酸[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正?；そM織相比，RA患者的PADI4表達(dá)量特異性增高[3]。本課題組前期研究中第一次發(fā)現(xiàn)了PADI4通過抑制FLS的凋亡來促進(jìn)RA的發(fā)生發(fā)展。PADI4的下調(diào)可增加RA-FLS的凋亡，而PADI4的上調(diào)可降低RA-FLS的凋亡。機(jī)制層面，PADI4可破壞組蛋白H3精氨酸修飾并抑制p21轉(zhuǎn)錄，使我們對(duì)PADI4在RA發(fā)生發(fā)展中的抗凋亡作用有了更深刻的理解[13]。

近年來無(wú)機(jī)材料因?yàn)槠渖锒栊院土己玫奈锢硇阅芸煽匦?，已?jīng)被廣泛應(yīng)用到藥物(包括化療藥物和核酸)輸送和成像方面。與病毒載體相比，他們的優(yōu)勢(shì)有粒徑小，可塑性強(qiáng)，易于修飾，低免疫原性，低細(xì)胞毒性和增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention，EPR)[14]。其中MSN由于其低成本、無(wú)毒性，高比表面積(意味著高藥物裝載量)，有序的孔道結(jié)構(gòu)，均一的孔徑，能夠自由分散遍及整個(gè)身體，高的siRNA結(jié)合能力，易于修飾的表面結(jié)構(gòu)和生物相容性等特點(diǎn)作為藥物載體被廣泛研究[7,15]。MSN作為siRNA的載體已經(jīng)有較多的報(bào)道，一般在其表面包被一層PEI,一方面有利于結(jié)合帶負(fù)電荷的siRNA，另一方面PEI可與負(fù)電荷的細(xì)胞膜作用促進(jìn)納米粒子轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因的下調(diào)[16-19]，但這些研究的靶細(xì)胞均為腫瘤細(xì)胞，在本研究中靶細(xì)胞為RA-FLS，目前MSN應(yīng)用于RA-FLS的研究鮮有報(bào)道。

目前，siRNA在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)運(yùn)方法有許多，其中脂質(zhì)體為載體的應(yīng)用較為廣泛。本課題組前期研究中，龔如涵、宗明等[4]利用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染RA-FLS，成功干擾PADI4基因和蛋白水平的表達(dá)，引起RA-FLS凋亡增加，進(jìn)一步證實(shí)了PADI4在RA-FLS細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用，可能在RA的發(fā)病中起著一定的作用。但脂質(zhì)體也存在著靶向性不夠明顯、包封率低、穩(wěn)定性差和制備工藝復(fù)雜等一些不足之處。

本研究中，采用模板法制備MSN，按照國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)的定義[20]，多孔材料按照孔徑大小可分為三類：小于2 nm的為微孔，2～50 nm的為介孔，大于50 nm的為大孔。本研究合成的孔徑大小約為8 nm，因此為介孔材料。TEM結(jié)果可看到制備的MSN有很多規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)，這些孔道結(jié)構(gòu)為功能化集團(tuán)如藥物分子、熒光分子等提供了足夠的空間。本研究中在MSN表面包被熒光標(biāo)記分子RhB、陽(yáng)離子聚合物PEI， MSN經(jīng)PEI修飾后，電荷密度增大，約為+37左右，單分散性高，粒徑檢測(cè)結(jié)果約為270 nm，相比PEI修飾前粒徑明顯減小，主要原因是修飾PEI后，粒子表面正電荷密度增大，粒子間電荷排斥力增加，增加粒子的分散性，利于作用進(jìn)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。

MSN成功制備并修飾后，包載PADI4-siRNA，構(gòu)建PADI4-siRNA-MSN，轉(zhuǎn)染RA-FLS，結(jié)合MSN的熒光標(biāo)記RhB和siRNA的熒光標(biāo)記FAM，采用FCM鑒定PADI4-siRNA-MSN的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果顯示可達(dá)90%以上。但結(jié)果中檢測(cè)到的RhB和FAM熒光信號(hào)有差別，可能是因?yàn)楸狙芯恐蠷hB標(biāo)記MSN的方式為物理吸附，在轉(zhuǎn)染過程中，熒光分子從孔道中擴(kuò)散出來，被細(xì)胞代謝掉，后續(xù)研究中可以通過對(duì)MSN進(jìn)一步的化學(xué)修飾來改善此問題。CLSM結(jié)果顯示PADI4-siRNA-MSN已攝取入胞并分布在核周。熒光定量PCR、蛋白印跡結(jié)果顯示兩對(duì)siRNA在基因及蛋白水平均能抑制PADI4的表達(dá)。與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RA-FLS細(xì)胞凋亡率(6%左右)相比[4]，本研究中細(xì)胞凋亡率(12%左右)顯著增高。

本研究結(jié)果表明MSN在RA中有一定的應(yīng)用前景。在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步深入研究靶向RA-FLS的PADI4-siRNA-MSN的構(gòu)建以及MSN在RA動(dòng)物模型中的應(yīng)用?？傊?，MSN的諸多優(yōu)點(diǎn)使其將來在RA醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在RA基因治療方面的應(yīng)用有光明的前景。