BCG免疫對2型糖尿病小鼠血糖和免疫應答的影響①

王 辛 寧喚喚 翟佳佳 康 健 柏銀蘭 周 潔

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安710032)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。目前我國成人糖尿病的患病率為10.9%[1]，其中2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者90%以上，但其發(fā)病機制尚未闡明。研究顯示T2DM是一種自身免疫性和炎癥性疾病[2]，是一種“慢性低度炎癥狀態(tài)”，認為炎癥、免疫與T2DM 的發(fā)病密切相關。Duncan等[3]研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸、血清黏液蛋白、白細胞介素(Interleukin，IL) 、C反應蛋白等水平升高與T2DM 的發(fā)生相關，提出“炎癥學說”，即當肥胖、游離脂肪酸和晚期糖基化終末產(chǎn)物增加，激活天然免疫產(chǎn)生大量的細胞因子，如TNF-α、IL-6等，誘導胰島β細胞凋亡和干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導，引起胰島素分泌減少和胰島素抵抗，最終引起糖尿病。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)是世界范圍內(nèi)應用最廣泛的結核病疫苗。BCG對固有免疫和適應性免疫均具有調(diào)節(jié)作用[4]：增強巨噬細胞吞噬作用，分泌趨化因子和細胞因子；促進樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)活化、成熟和遷移，提高其抗原提呈能力，促進細胞因子分泌，增強細胞免疫；誘導B淋巴細胞產(chǎn)生大量免疫球蛋白，其中IgA促進吞噬作用，IgG增強細胞介導的細胞毒作用；刺激CD4+和CD8+T細胞增殖，CD4+T細胞分化產(chǎn)生大量Th1和Th2型細胞因子。BCG對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，使其成為一種重要的佐劑，是常用的弗氏完全佐劑的主要成分。在臨床上，卡介苗灌注治療已成為淺表性膀胱癌最重要的免疫療法[5]。

研究顯示，1型糖尿病(T1DM)患者接種BCG后，可誘導TNF-α產(chǎn)生，使自身反應性T細胞選擇性死亡，并促進調(diào)節(jié)性T細胞增殖，有助于修復胰島細胞，促進胰島素分泌[6]。目前在國外已經(jīng)進入1期臨床試驗階段[7]。BCG免疫對2型糖尿病的免疫調(diào)節(jié)作用未見報告，本文探究BCG免疫對小鼠2型糖尿病模型的血糖和免疫應答的影響，為2型糖尿病防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 4周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠24只，購于空軍軍醫(yī)大學(原第四軍醫(yī)大學)動物實驗中心。小鼠隨機分為4組(n=6)：正常對照組(Normal)、糖尿病組(DM)、免疫組(BCG)、免疫糖尿病組(BCG+DM)。

1.1.2菌株 將BCG(ATCC 35734)接種于7H9培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)3周，收集細菌沉淀，保存于-80℃。使用前采用平板計數(shù)法計算活菌數(shù)，重復3次。

1.1.3試劑與儀器 鏈尿佐菌素(Streptozotocin，STZ)購于美國Sigma公司。血糖儀及試紙為德國羅氏的卓越型血糖檢測系統(tǒng)(檢測范圍0.6～33.3 mmol/L即10～600 mg/dl)，超過檢測上限的記錄為33.3 mmol/L。小鼠高糖高脂飼料購于北京博愛港商貿(mào)中心，配方：65%小鼠維持飼料，10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鈉。細胞因子ELISA檢測試劑盒、熒光標記的抗CD4 mAb、抗CD8 mAb為美國ebiosicence產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1BCG免疫 免疫組小鼠采用尾靜脈注射方法接種BCG，劑量為5×104CFU/100 μl/只；對照組注射 100 μl生理鹽水。

1.2.22型糖尿病小鼠模型的建立[8]BCG免疫6周后，糖尿病組、免疫糖尿病組喂高糖高脂飼料。高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，正常對照組、糖尿病組及免疫糖尿病組小鼠禁食不禁水14 h，正常對照組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液，糖尿病組及免疫糖尿病組小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg體重，連續(xù)注射3 d。1周后，小鼠尾靜脈采血測量隨機血糖3次，血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠表明模型建立成功。糖尿病組、免疫糖尿病組小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料12周。觀察小鼠一般狀況，每周測量小鼠體重。

1.2.3空腹血糖 每間隔2周各組小鼠禁食不禁水8 h，尾靜脈采血，使用羅氏血糖儀檢測小鼠空腹血糖水平。

1.2.4口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose toleran-ce，OGTT)[9]小鼠禁食不禁水14 h，尾靜脈采血測量空腹血糖(0 min)后，按 2 g/kg體重葡萄糖溶液灌胃，記錄30 min、60 min及120 min時血糖值。

1.2.5小鼠脾淋巴細胞分離及體外刺激培養(yǎng) 無菌分離小鼠脾臟，加入4 ml RPMI1640培養(yǎng)液，研磨成勻漿，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入ACK紅細胞裂解液 5 ml裂解2 min后，加入5 ml RPMI1640培養(yǎng)液，充分混勻，終止裂解，1 500 r/min離心5 min，細胞沉淀加入5 ml RPMI1640培養(yǎng)液洗滌并離心后，用含10%FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，3%臺盼藍染色并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為107個/ml，接種96孔板100 μl/孔。實驗組分別加入刺激抗原BCG菌體蛋白100 μl(終濃度為25 μg/ml)、ConA 100 μl(終濃度為3 μg/ml)，對照組加入100 μl RPMI1640完全培養(yǎng)液。

1.2.6小鼠脾淋巴細胞增殖實驗 脾淋巴細胞分離和抗原刺激同上，BCG抗原刺激組培養(yǎng)68 h、ConA抗原刺激組培養(yǎng)44 h時，分別加入20 μl/孔的MTS(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀檢測OD490。脾淋巴細胞增殖指數(shù)SI=OD490(實驗組-空白對照)/ OD490(陰性對照-空白對照)。

1.2.7小鼠脾淋巴細胞CD4+與CD8+T細胞所占百分比的分析 取2×106個無菌分離的小鼠脾淋巴細胞，加入PE標記的抗CD4 mAb及FITC標記的抗CD8 mAb，避光4℃孵育30 min，PBS洗滌2 次。200 μl 固定液固定，流式細胞術檢測CD4+與CD8+T細胞百分比。

1.2.8脾淋巴細胞因子分泌水平檢測 BCG抗原刺激組培養(yǎng)72 h，ConA抗原刺激組培養(yǎng)48 h后，收集各組抗原刺激后的脾淋巴細胞培養(yǎng)上清，ELISA試劑盒分別檢測上清中細胞因子的含量。按照說明書提前一天包被需檢測的抗體，100 μl/孔，4℃過夜，PBST洗滌，加入封閉液200 μl/孔，室溫孵育1 h，加入待檢測樣品和標準品100 μl/孔，室溫孵育2 h，PBST洗滌，加入生物素標記抗體工作液100 μl/孔，室溫孵育1 h，PBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μl/孔，室溫孵育30 min，PBST洗滌，加入TMB顯色液100 μl/孔，待顏色出現(xiàn)變化，立即加入終止液，用酶標儀檢測OD450。

1.3統(tǒng)計學方法 利用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗，P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1體重 糖尿病組、免疫組和免疫糖尿病組小鼠一般狀況觀察：進食、飲水和活動與正常組小鼠相比無顯著異常。小鼠體重均呈上升趨勢，各組間差異差異無顯著統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.2空腹血糖 在13周時糖尿病組小鼠和免疫糖尿病組小鼠隨機血糖超過11.1 mmol/L，表明造模成功(圖2A)。糖尿病組小鼠14周空腹血糖顯著升高，達到(14.70±2.03)mmol/L(P<0.001)，高血糖水平持續(xù)到24周(15.63±3.90)mmol/L。免疫糖尿病組小鼠空腹血糖在14周達到高峰，為(7.85±0.81)mmol/L，但其峰值僅是糖尿病組的53%。24周空腹血糖降至(4.33±0.52)mmol/L，顯著低于糖尿病組(P<0.01)。正常對照組和免疫組空腹血糖無明顯升高(P>0.05)(圖2B)。

圖1 小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes of mice

圖2 小鼠隨機血糖和空腹血糖變化Fig.2 Random blood glucose and fasting blood glucose changes in miceNote: A.Random blood glucose in mice at 13 weeks;B.Fasting blood glucose in mice.DM group compared with BCG+DM group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3口服葡萄糖耐量(OGTT)試驗 24周進行OGTT試驗，糖尿病組小鼠空腹血糖為(15.63±3.90)mmol/L， 葡萄糖溶液灌胃后血糖立即上升，120 min后血糖仍高達(24.57±1.33)mmol/L， 顯著高于正常對照組(P<0.001)。免疫糖尿病小鼠空腹血糖與正常對照組持平，葡萄糖溶液灌胃30 min后有升高趨勢，但是與正常對照組無差異；灌胃60 min后高于正常對照組(P<0.01)，120 min后雖然仍高于正常對照組(P<0.05)，但顯著低于糖尿病組(P<0.05)；表明BCG免疫抑制糖尿病小鼠空腹和糖負荷后的血糖水平。免疫組小鼠血糖與正常對照組無明顯差異(P>0.05)，表明BCG免疫對正常小鼠糖負荷后的血糖水平不產(chǎn)生影響(圖3)。

圖3 小鼠口服糖耐量試驗結果Fig.3 Results of oral glucose tolerance test in miceNote: Compared with normal group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;comparison of tagged groups, #.P<0.05,##.P<0.01.

圖4 各組小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)(SI)Fig.4 Spleen lymphocytes proliferation of mice(SI)Note: A.Stimulated index(SI) of splenic lymphocytes stimulated by BCG protein;B.Stimulated index(SI) of splenic lymphocytes stimulated by ConA protein.Compared with normal group,**.P<0.01,***.P<0.001;comparison of tagged groups, #.P<0.05.

圖5 小鼠脾淋巴細胞CD4+與CD8+T細胞所占百分比Fig.5 Percentages of CD4+ and CD8+ T cells in splenic lymphocytesNote: Compared with normal group,**.P<0.01,***.P<0.001;comparison of tagged groups, #.P<0.05,##.P<0.01.

圖6 各組小鼠脾淋巴細胞細胞因子分泌水平Fig.6 Cytokines production of mice splenic lymphocytesNote: A-D.Splenic lymphocytes stimulated by BCG protein;E-H.Splenic lymphocytes stimulated by ConA protein.Compared with normal group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;compared of tagged groups, #.P<0.05,##.P<0.01.

2.4小鼠脾淋巴細胞增殖 BCG、ConA抗原刺激后，與正常小鼠相比，免疫組和免疫糖尿病組小鼠脾淋巴細胞增殖差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；ConA刺激下，免疫糖尿病組脾淋巴細胞增殖顯著高于糖尿病組(P<0.05)(圖4)。

2.5小鼠脾淋巴細胞CD4+T細胞與CD8+T細胞所占百分比 與正常組相比，免疫組和免疫糖尿病組小鼠CD4+T細胞和CD8+T細胞百分比顯著升高(P<0.01)，CD4+T細胞與CD8+T細胞之和亦顯著升高(P<0.01)。免疫糖尿病組顯著高于單純糖尿病組(P<0.05)。而各組間CD4+T細胞與CD8+T細胞比值無明顯變化(圖5)。

2.6脾淋巴細胞因子分泌水平 BCG抗原刺激后，免疫組及免疫糖尿病組小鼠脾淋巴細胞Th1型細胞因子IFN-γ分泌顯著高于正常對照和糖尿病組(P<0.001，P<0.05)。ConA抗原刺激后，免疫糖尿病組小鼠脾淋巴細胞IL-2分泌顯著低于糖尿病組(P<0.05)。BCG、ConA抗原刺激后，糖尿病組小鼠脾淋巴細胞分泌Th2型細胞因子IL-6顯著增加(P<0.001，P<0.01)，與之前研究糖尿病患者血清中IL-6顯著升高相一致[10]，而BCG免疫糖尿病小鼠IL-6水平顯著低于糖尿病組(P<0.05)。各組間IL-10分泌水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。

3 討論

小鼠模型是研究T2DM發(fā)病機制常用的動物模型。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合多次低劑量腹腔注射STZ方法構建2型糖尿病模型：通過高糖高脂飲食誘導小鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ損傷胰島功能，引起血糖升高，模擬T2DM的發(fā)病過程[11]。該方法是目前國內(nèi)外制作糖尿病動物模型最常用的方法[12]。本研究中糖尿病組和免疫糖尿病組小鼠均在13周成模，整個實驗觀察期間，糖尿病組小鼠始終維持高血糖狀態(tài)。該造模方法操作簡單，成模率高，而且STZ對胰島β細胞有特異性殺傷作用，因此該模型也可用于糖尿病發(fā)病機制的研究。

T2DM是一種自身免疫性和低度炎癥性疾病[13]，其特征性的促炎性細胞因子釋放，如TNF-α、IL-6、IL-1β等共同作用產(chǎn)生細胞毒性，誘導胰島β細胞凋亡；同時炎癥因子干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導的絲氨酸/蘇氨酸激酶如c-JUN氨基末端激酶(JUK)、核因子(NF-κB)抑制物激酶(IKK)等，導致胰島素抵抗。在T2DM發(fā)病機制中IL-6是一個重要的炎性因子，其低峰度表達時促進胰島素分泌[14]，高峰度表達時則會損傷胰島β細胞，誘導TNF-α、IL-1β、IL-2產(chǎn)生增加[15,16]，激活caspase通路和NF-κB通路促進細胞凋亡[17,18]，從而損傷胰島細胞，減少胰島素分泌。此外，IL-6增加脂肪細胞的脂肪分解和游離脂肪酸的釋放，從而破壞線粒體和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)的功能，進而使胰島素敏感性降低[19]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組小鼠脾淋巴細胞分泌IL-6、IL-2均較正常對照組有所升高，尤其是IL-6顯著升高(圖6)，證明T2DM發(fā)病機制確實與免疫反應及炎癥相關。

BCG為減毒活疫苗，具有很強的非特異性免疫刺激作用，可刺激CD4+T和CD8+T細胞增殖，同時是一種Th1型免疫反應的誘導劑，它可刺激Th1淋巴細胞的發(fā)育和大量巨噬細胞聚集、活化，抑制Th2型免疫反應。本研究發(fā)現(xiàn)BCG免疫可使糖尿病小鼠脾淋巴細胞增殖增加，CD4+和CD8+T細胞同時增高，Th1型典型細胞因子IFN-γ分泌增加，而Th2型細胞因子IL-10不升高。值得注意的是，BCG免疫可抑制糖尿病組Th2型細胞因子IL-6的升高，在此作用下，BCG免疫糖尿病組血糖升高幅度低于糖尿病組，不僅如此，BCG免疫糖尿病組小鼠維持高血糖的時間明顯短于糖尿病組。綜上，BCG免疫調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)，抑制了糖尿病炎性因子的升高，進而減輕了炎性因子對胰島細胞損傷和對胰島敏感性的影響，使血糖升高的趨勢和強度減弱。

T2DM是一種免疫、炎癥相關疾病，大量炎性因子參與破壞胰島細胞功能，并在胰島素抵抗中起到重要的作用。現(xiàn)已證明，糖尿病患者長時間處于高血糖狀態(tài)無疑會促進多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結果顯示，T2DM的發(fā)生發(fā)展與炎性因子水平相關，而BCG免疫可抑制炎性因子如IL-6的水平，減輕胰島炎性反應和改善胰島素抵抗，從而抑制T2DM的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究結果具有潛在的臨床意義：BCG可作為免疫佐劑，延緩T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。BCG調(diào)節(jié)糖尿病免疫應答的具體機制值得進一步深入研究。