探討B(tài)MSCs在治療大鼠腦損傷時(shí)的量效關(guān)系

王英杰 王 晶 石 鑫

(承德醫(yī)學(xué)院，承德067000)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是人身體疾病中較為復(fù)雜并難以解決的器官性疾病[1]，當(dāng)損傷發(fā)生后，醫(yī)護(hù)工作人員除了給予常規(guī)的治療外，并沒有十分有效的治療手段，也不能保證治療后的功能得到良好的康復(fù)[2]。TBI現(xiàn)在已經(jīng)被視為是影響社會、家庭、個(gè)人的經(jīng)濟(jì)以及生活的重要因素之一。所以，在現(xiàn)有的臨床治療中發(fā)現(xiàn)一個(gè)切實(shí)可行的治療方案或藥物，是刻不容緩的重要課題。在創(chuàng)傷發(fā)生后，因?yàn)榇竽X的海馬區(qū)受到了損傷，導(dǎo)致其所控制的學(xué)習(xí)、記憶等功能也發(fā)生了損傷性的功能障礙[3,4]。有研究表明當(dāng)TBI發(fā)生后自噬也同時(shí)被激活。自噬(Autophagy)為所有真核細(xì)胞內(nèi)最為普遍的生理現(xiàn)象，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝和某些細(xì)胞器的更新[5,6]。自噬最初被認(rèn)為是另一種細(xì)胞的程序化死亡，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)了自噬和凋亡并不是同一概念，凋亡是導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，而自噬卻是對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重復(fù)利用。所以自噬現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)研究中要區(qū)分對待，其他研究表明抑制自噬能減輕TBI和提高神經(jīng)功能恢復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦損傷模型，并使用BMSCs進(jìn)行治療，檢測動物行為學(xué)的變化，以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究不同劑量的BMSCs移植對大鼠腦損傷治療產(chǎn)生的影響，為BMSCs在臨床上治療腦損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 BMSCs的供體動物：SPF級幼年雄性SD大鼠6只，3～5周齡，體重90～110 g。BMSCs的受體動物：SPF級成年雌性SD大鼠90只，體重180～220 g，均購自于北京維通利華動物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離及培養(yǎng) 使用乙醚麻醉大鼠，然后處脫頸處死大鼠，在無菌的條件下將股骨和脛骨分離，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，并收集沖洗液，1 000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后按1×106cm-2密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行第一次換液，第二次以后換液間隔2～3天1次。待細(xì)胞95%融合時(shí)，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物與分組 SPF級健康成年雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g。在實(shí)驗(yàn)前讓大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將50只SD雌性大鼠隨機(jī)分為5組：對照組、腦創(chuàng)傷模型組、BMSCs治療1組(1×106ml-1)、BMSCs治療2組(3×106ml-1)、BMSCs治療3組(6×106ml-1)。治療組分別在模型建立成功后的第28天經(jīng)尾靜脈注射給予不同劑量的BMSCs與DMEM懸液1.0 ml。

1.2.3腦組織形態(tài)學(xué)檢測 大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量對大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后將大鼠斷頭，分離腦組織，于視交叉后1和6 mm的位置冠狀面切開修塊，最后剩下大鼠腦的海馬位置，在4%多聚甲醛固定液中固定48 h，按照梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照留圖。

1.2.4Morris水迷宮測試 對照組、模型組、BMSCs治療1組、BMSCs治療2組、BMSCs治療3組大鼠分別于傷后6、7、8、9 d進(jìn)行水迷宮測試。檢測時(shí)，把安全島采取隨機(jī)的方式放到水迷宮四個(gè)象限(N、S、E、W)中的一個(gè)象限中，加水，高過安全島1 cm，水的溫度維持在22～24℃，攝像機(jī)及計(jì)算機(jī)會自動追蹤大鼠的活動路線，以及尋找時(shí)間。180 s內(nèi)仍沒找到安全島，則潛伏期時(shí)間為180 s。

1.2.5免疫印跡法檢測LC-3和Beclin-1的表達(dá)量 將所獲取的大鼠腦海馬組織從-80℃超低溫冰箱中取出，然后將腦組織剪碎，按照100 mg/1 ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低溫離心15 min，然后凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，一抗孵育，并在4℃環(huán)境下過夜，第二天二抗孵育2 h。用ECL顯色液進(jìn)行曝光，使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代BMSCs在 48 h之內(nèi)貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細(xì)胞形態(tài)基本為均勻星形或梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細(xì)胞。經(jīng)過BMSCs純化，其他非貼壁細(xì)胞，通過換液逐漸減少。2 周后原代細(xì)胞 95% 融合，進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀和放射狀集落生長傾向，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)更為均一，為梭形成纖維細(xì)胞樣，見圖1。

2.2HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，在對照組中腦的組織結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，血管的管腔中沒有發(fā)現(xiàn)異常，血管的管壁平整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則；在創(chuàng)傷后，模型組神經(jīng)元細(xì)胞胞體出現(xiàn)形狀的改變，胞漿染色降低，細(xì)胞核出現(xiàn)深度染色，能夠看到在細(xì)胞之間出現(xiàn)了明顯的間隙，并且伴有壞死的神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)，治療1、2組與模型組比較病理改變明顯減輕，治療3組沒有減輕，有加重趨勢出現(xiàn)，見圖2。

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(×200)Fig.1 Morphological observation of BMSC(×200)Note: A.Primary cells；B.The third passage BMSCs.

圖2 各組HE結(jié)果(HE staining，× 200)Fig.2 Morphological observation of lung tissue in each group(HE staining，× 200)Note: A.Control group;B.Model group;C.Treatment group 1;D.Treatment group 2;E.Treatment group 3.

2.3Morris水迷宮結(jié)果 因?yàn)樵谀X創(chuàng)傷后，大鼠的運(yùn)動能力會受到一定的影響，所以設(shè)置的實(shí)驗(yàn)時(shí)間在各每組創(chuàng)傷后的第6、7、8和9天進(jìn)行Morris水迷宮檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組在傷后第8天和第9天搜索安全島潛伏期明顯要比對照組時(shí)間增加。治療1、2組在傷后第8天和第9天搜索安全島潛伏期要比對照組有顯著的縮短，說明大鼠的記憶功能得到了一定的恢復(fù)，治療1組的時(shí)間比治療2組的要短，治療3組搜索安全島潛伏期與模型組略又增加，差異不明顯，見圖3和表1。

2.4LC-3和Beclin-1的Western blot檢測結(jié)果 LC-3結(jié)果顯示出深淺不同的雙條帶LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。以LC-3Ⅱ的表達(dá)高低反應(yīng)自噬的水平。對照組LC-3和Beclin-1蛋白有微量基礎(chǔ)表達(dá)。與對照組相比較，模型組LC-3和Beclin-1蛋白的表達(dá)有顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療1、2組蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)，但仍高于對照組表達(dá)量，治療1組的蛋白表達(dá)比治療2組的表達(dá)相對減弱，治療3組與模型組相比較蛋白的表達(dá)有明顯的升高。見圖4。

圖3 水迷宮運(yùn)動軌跡Fig.3 Moving track of morris water mazeNote: A.6 d;B.7 d;C.8 d;D.9 d.*.P<0.05 vs control goup；△.P<0.05 vs model group;#.P<0.05 vs treatment group.

表1水迷宮運(yùn)動變化數(shù)據(jù)

Tab.1Movementdataofwatermaze

GroupsTime6 d7 d8 d9 dControl group17.454 6±3.343 515.478 4±3.548 512.265 2±1.569 18.589 1±1.326 3Model group159.667 9±3.235 7140.767 8±4.588 7102.256 7±3.458 51)77.753 2±2.857 51)Treatment group 1103.857 9±5.752 071.055 3±3.757 952.725 5±3.557 52)27.475 3±2.577 52)Treatment group 2109.768 8±3.953 179.213 8±3.445 457.572 8±3.007 92)3)30.485 1±2.434 52)3)Treatment group 3132.674 8±3.589 7122.234 4±4.125 891.456 7±3.579 52)59.457 6±3.757 82)

Note：1)P<0.05 vs Control group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Treatment group 1.

圖4 各組LC-3和Beclin-1的蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expression of LC-3 and Beclin-1 in each groupNote: A.LC-3；B.Beclin-1.*.P<0.05,treatment group 1,2 vs model group;#.P<0.05,model group vs control group.

3 討論

BMSCs具有很強(qiáng)的自我更新和多方向分化的能力，BMSCs分化的順序是從中胚層生成，從肌肉再到骨然后到軟骨最后到達(dá)脂肪和肌腱[8]。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)研究以及相關(guān)文獻(xiàn)證明，BMSCs在內(nèi)環(huán)境中能夠向受到損傷的組織器官、炎癥以及腫瘤位置進(jìn)行遷移，并對組織的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行修復(fù)。而且BMSCs自身擁有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，進(jìn)行異體移植時(shí)能夠避免免疫排斥反應(yīng)[9]。因此，BMSCs在臨床許多疾病的治療中都發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：HE染色結(jié)果，模型組神經(jīng)元細(xì)胞胞體發(fā)生明顯改變，胞漿染色降低，細(xì)胞核出現(xiàn)深度染色，并且伴有壞死的神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)，治療1、2組同模型組比較病理可以看到有明顯的減輕，治療3組病理改變出現(xiàn)加重，這說明BMSCs對大鼠腦創(chuàng)傷后的治療存在著一定的量效關(guān)系；Morris水迷宮結(jié)果顯示，在腦創(chuàng)傷后，模型組在搜索安全島所用的時(shí)間明顯要比對照組所用的時(shí)間要多，治療1、2組的搜索時(shí)間要比模型組有了明顯的好轉(zhuǎn)，治療1組的用時(shí)最短，治療3組效果不明顯，這說明大鼠的空間記憶功能有了一定程度的改善，但BMSCs對大鼠腦創(chuàng)傷后的治療存在著一定的量效關(guān)系；Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組LC-3和Beclin-1蛋白表達(dá)出現(xiàn)了顯著升高，與模型組相比，治療1、2組蛋白表達(dá)明顯減弱，治療1組的蛋白表達(dá)最弱，而治療3組與模型組相比較蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，這進(jìn)一步說明大鼠腦創(chuàng)傷后BMSCs治療對大鼠腦創(chuàng)傷后的恢復(fù)起到了一定的作用，但是BMSCs與大鼠腦創(chuàng)傷后的治療之間存在著一定的量效關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出，BMSCs能夠?qū)Υ笫蟮哪X損傷起到一定的修復(fù)作用，但是也存在著一定的量效關(guān)系，即1×106ml-1的BMSCs是最佳的治療劑量。3×106ml-1以及6×106ml-1能夠起到一定的作用，但是治療效果不是很理想。

綜上所述，本研究證實(shí)了BMSCs對創(chuàng)傷性腦損傷的治療有明顯的作用效果，但是BMSCs的治療效果與移植的劑量有直接關(guān)系，為BMSCs面向臨床的應(yīng)用提供了有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。