葉明皓，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，劉小雪，宋亞嬌

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

雷氏普羅威登斯菌屬于腸桿菌科Enterobacteriaceae、普羅威登斯菌屬Providencia[1]。研究表明，人類感染雷氏普羅威登斯菌可引發(fā)腹瀉、肺炎、尿道炎等多種疾病[2-3]。近年來，雷氏普羅威登斯菌可導(dǎo)致魚、蝦、鱉等多種水產(chǎn)動物發(fā)病死亡[4-6]。Faisal等[4]從瀕死尼羅羅非魚Oreochromisniloticus體內(nèi)分離得到雷氏普羅威登斯菌。Bejarano等[5]從瀕死鰱Hypophthalmichthysmolitrix心臟、腎臟等組織分離獲得雷氏普羅威登斯菌。戰(zhàn)文斌等[6]從患敗血病對蝦Fenneropenaeuschinensis體內(nèi)分離出雷氏普羅威登斯菌。范紅結(jié)等[7]從患病中華鱉Trionyxsinensis肝、脾和肺等實質(zhì)器官均分離鑒定到雷氏普羅威登斯菌。李林俐等[8]對發(fā)病與死亡揚(yáng)子鱷Alligatorsinensis進(jìn)行病原學(xué)分離研究，鑒定病原菌為雷氏普羅威登斯菌。但是，關(guān)于雷氏普羅威登斯菌感染龜鱉類動物導(dǎo)致眼炎病例，目前尚未見文獻(xiàn)報道。

近年來，由于養(yǎng)殖水環(huán)境污染加劇，龜類細(xì)菌性疾病頻繁發(fā)生，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-13]。楊瑞婷[13]報道，巴西龜眼炎主要表現(xiàn)為眼瞼發(fā)炎充血，后逐漸變成灰白色且腫大，眼角膜和鼻黏膜糜爛，嚴(yán)重時雙目失明，呼吸受阻等。最近，天津市某寵物龜養(yǎng)殖場的巴西龜發(fā)病，主要表現(xiàn)為眼睛發(fā)炎充血、腫大，精神沉郁、行動緩慢，攝食減少或停止攝食等臨床癥狀，初步診斷為細(xì)菌性眼炎病例。本研究中，從發(fā)病龜眼內(nèi)黏液中分離獲得1株細(xì)菌，并對其進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA測序、生理生化特性、藥敏試驗、回歸感染試驗及病理學(xué)觀察等系統(tǒng)研究，旨在為研究巴西龜眼炎的病原及其致病機(jī)理等提供數(shù)據(jù)資料，為該病的防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康巴西龜購自天津水產(chǎn)市場(體質(zhì)量約8.0 g)，在實驗室飼養(yǎng)觀察2周，確認(rèn)健康無病后用于后續(xù)試驗。發(fā)病巴西龜(體質(zhì)量約150.0 g)為天津市某寵物龜養(yǎng)殖場的送檢病龜。

細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司，PCR Master Mix試劑購自北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司，膠回收DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 參照蘭云等[9]的試驗方法，將發(fā)病巴西龜體表病灶用無菌生理鹽水沖洗，無菌操作取患病龜眼部組織及其分泌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫下培養(yǎng)18 h。挑取優(yōu)勢單菌落接種純化，經(jīng)過3次純化后得到純菌種，置于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌生理生化試驗 將分離純化后的菌株28 ℃下培養(yǎng)18 h，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將菌株無菌操作接種于細(xì)菌生化鑒定管中，進(jìn)行硝酸鹽還原、半固體動力、糖(醇、苷)類代謝等48種生理生化特性測定，具體方法參照文獻(xiàn)[14-15]。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取及16S rDNA基因序列擴(kuò)增 將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)過夜，取2 mL培養(yǎng)液于離心管中，4 ℃下以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加500 μL超純水，漩渦振蕩30 s，置95 ℃下水浴5 min；再于4 ℃下以12 000 r/min離心2 min，取350 mL上清液為DNA模板，保存于-20 ℃中備用。

細(xì)菌的16S rDNA測序采用通用引物27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′，1492R:5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′，引物來自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqPCR Master Mix 10L，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌雙蒸水11 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，并將PCR產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測序。用膠回收試劑盒回收純化16S rDNA目的條帶，與pMD18-T載體連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，采用引物M13-47:5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′，RV-M:5′ GAGCGGATAACAATTTC- ACACAGG 3′進(jìn)行菌落PCR陽性克隆篩選，隨機(jī)取陽性克隆送天津金唯智生物科技有限公司測序驗證。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將16S rDNA序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，同時在NCBI下載已公布的普羅威登斯菌屬細(xì)菌16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 5.2軟件用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過1000次的自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測。

1.2.5 藥敏試驗 采用K-B紙片法對分離菌株進(jìn)行29種常用抗生素藥物的敏感性檢測，將分離菌株均勻涂布于LB平板上，依次貼上藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)18 h后，測量抑菌圈直徑，測量3次取其平均值，以抑菌圈直徑大小作為判定細(xì)菌對藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 動物感染試驗 隨機(jī)選取20只健康巴西龜作為試驗動物，感染組龜10只采取人工腹腔注射含菌量為1.88×108cfu/mL菌液，注射量為0.1 mL/只，對照組龜10只注射相同劑量的0.1 mL無菌生理鹽水；飼養(yǎng)溫度約為20 ℃，連續(xù)觀察21 d，記錄發(fā)病死亡情況。參照李玉平等[12]的方法對試驗龜進(jìn)行組織病理觀察，無菌操作取正常和發(fā)病死亡巴西龜眼瞼等組織放入波恩氏液中固定，用常規(guī)石蠟切片、H.E染色，觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西龜眼炎病原菌的分離及理化特性

巴西龜發(fā)病主要表現(xiàn)為眼睛發(fā)炎充血、腫大，行動遲緩，攝食減少等臨床癥狀，初步診斷為細(xì)菌性眼炎，從發(fā)病龜眼內(nèi)分泌液中分離獲得1株革蘭氏陰性細(xì)菌，編號為G0503菌株。該菌在LB培養(yǎng)基28 ℃下培養(yǎng)18 h，菌落形態(tài)呈圓形、邊緣整齊、透明濕潤，直徑為1.0～1.5 mm，該分離菌經(jīng)染色鏡檢顯示為革蘭氏染色陰性短桿狀細(xì)菌。細(xì)菌生理生化試驗結(jié)果表明，該菌株與半乳糖、甘露醇、肌醇、甘露糖等反應(yīng)為陽性，與賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶等反應(yīng)為陰性，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)和理化特性，基本符合普羅威登斯菌屬Providencia細(xì)菌的生理生化特征(表1)。

表1 菌株G0503的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain G0503

注：+ 表示陽性;-表示陰性;F表示發(fā)酵型

Note： +,positive; -,negative；F,fermentative type

2.2 分離菌的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以分離菌 株G0503基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測出大小約為1500 bp的目的條帶(圖1泳道1、2)，PCR產(chǎn)物測序獲得16S rDNA片段大小為1386 bp；進(jìn)一步將其亞克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中后篩選陽性克隆(圖1泳道3、4、5)，測得16S rDNA長度為1500 bp (GenBank登錄號：MG138153)。Blast比對結(jié)果表明，與模式菌株P(guān)rovidenciarettgeriDSM 4542(AM040492.1)的16S rDNA序列一致性均為99.30%，與Providenciarettgeri(JN644501.1)的16S rDNA序列一致性為99.60%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示,分離菌株G0503與Providenciarettgeri(JN644501.1)親緣關(guān)系最近，自然聚為一支(圖2)，最終判定G0503菌株為雷氏普羅威登斯菌。

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1、2為16S rDNA，3、4、5為陽性克隆Note: M,DNA standard DL 2000; 1 and 2, 16S rDNA, 3, 4 and 5, positive clones圖1 菌株G0503的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增及陽性克隆檢測Fig.1 PCR amplification and detection of 16S rDNA positive clone in the strain G0503

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株G0503系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain G0503 based on gene sequence of 16S rDNA

2.3 分離菌G0503的藥敏特性

藥敏試驗結(jié)果顯示：G0503菌株對頭孢噻肟、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星、美羅培南、亞胺培南等抗生素高度敏感；對頭孢克肟、鏈霉素、慶大霉素、新霉素等抗生素中度敏感；對阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、卡那霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶、萘啶酸、依諾沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、萬古霉素、克林霉素、利福平、呋喃唑酮、呋喃妥因等耐藥。

用G0503菌株人工腹腔注射健康巴西龜感染6 d后，試驗龜出現(xiàn)發(fā)病、死亡現(xiàn)象，21 d累積死亡率達(dá)40%(4/10)，感染龜主要臨床癥狀為眼睛腫大、發(fā)炎充血、眼分泌液增多(圖3)，精神沉郁，行動遲緩，攝食減少或停止攝食，偶有前肢抓撓眼部等現(xiàn)象。人工感染發(fā)病死亡巴西龜與自然發(fā)病癥狀基本相同，并且從病死龜體內(nèi)分離到與G0503菌株特征一致的細(xì)菌。注射生理鹽水的對照組龜，觀察21 d無發(fā)病死亡現(xiàn)象。進(jìn)一步進(jìn)行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，病龜眼瞼組織上皮細(xì)胞中的多邊形細(xì)胞消失，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、色素細(xì)胞增多等病變(圖4-A)，而對照組正常巴西龜眼瞼組織染色見圖4-B。

3 討論

3.1 雷氏普羅威登斯菌的致病性

普羅威登斯菌廣泛分布于土壤、水體等自然環(huán)境中[16]。雷氏普羅威登斯菌不僅影響魚、蝦、龜鱉、鱷等水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖[6，8，17]，而且對人類飲食構(gòu)成潛在危害[3,17]。目前，有學(xué)者研究認(rèn)為，雷氏普羅威登斯菌是條件致病菌，作為一種“人-獸-魚”共患病病原菌，主要導(dǎo)致心包炎、腹瀉、腹水等癥狀[18-19]。Zhang等[20]研究報道，雷氏普羅威登斯菌自然感染蠶導(dǎo)致敗血癥。最近，國內(nèi)學(xué)者從豬內(nèi)臟器官、糞便樣品中分離得到雷氏普羅威登斯菌[3,15]，并且證實對小鼠有較強(qiáng)致病性。也有報道雷氏普羅威登斯菌污染引起人食物中毒現(xiàn)象[21]。

注： A為眼睛腫大; B為黏液增多Note: A,eyes are swollen; B, increased mucus圖3 發(fā)病巴西龜癥狀Fig.3 Symptom of the turtle Trachemys scriptaelegans

注： A為患病巴西龜; B為健康巴西龜Note:A,diseased turtle; B,healthy turtle圖4 巴西龜眼瞼組織病理染色結(jié)果Fig.4 Pathological observation of turtle Trachemys scriptaelegans with ophthalmia

近幾年，關(guān)于雷氏普羅威登斯菌引發(fā)水產(chǎn)動物疾病等相關(guān)研究較受關(guān)注[3-8]。王建峰等[22]從國外船舶壓艙水中分離出雷氏普羅威登菌。Faisal等[4]等報道羅非魚發(fā)生大量死亡，病魚鰓發(fā)白、腫脹，嚴(yán)重腹水，并在病死魚的心、腎和脾中分離得到雷氏普羅威登斯菌。戰(zhàn)文斌等[6]在發(fā)病的中國對蝦淋巴液中分離出雷氏普羅威登斯菌，認(rèn)為該菌是對蝦細(xì)菌性敗血癥的病原。Bejarano等[5]研究表明，雷氏普羅威登斯菌是人工養(yǎng)殖鰱大量死亡的主要原因。陳永林等[23]從海洋館病死白鰭鯊Triaenodonobesus腹腔膿液、心血中分離到一株致病性雷氏普羅威登斯菌。李林俐等[8]報道揚(yáng)子鱷發(fā)病死亡，從其肝臟和血液中分離出雷氏普羅威登斯菌。范紅結(jié)等[7]從患病中華鱉肝、脾和肺中分離出相同的病原菌，經(jīng)鑒定為雷氏普羅威登斯菌，主要表現(xiàn)為鱉底板出血，肺、脾等內(nèi)臟干酪樣結(jié)節(jié)等臨床癥狀。本試驗中，從發(fā)病巴西龜眼部分泌液中分離到一株雷氏普羅威登斯菌G0503菌株，進(jìn)行了細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，人工感染巴西龜主要呈現(xiàn)眼睛發(fā)炎腫大、反應(yīng)呆滯、攝食減少或停止攝食等臨床癥狀，組織染色觀察發(fā)現(xiàn)，病龜出現(xiàn)眼瞼組織上皮細(xì)胞中的多邊形細(xì)胞消失，色素細(xì)胞增多等病理變化。

3.2 雷氏普羅威登斯菌的藥敏特性

由于抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖和疾病防控中的廣泛應(yīng)用，且濫用藥物現(xiàn)象時有發(fā)生，從而使魚類疾病防治面臨著新的挑戰(zhàn)與難題[6,8]。夏淑等[24]研究報道，人類雷氏普羅威登斯菌對喹諾酮類、β內(nèi)酰胺類及碳青霉烯類等抗生素耐藥。戰(zhàn)文斌等[6]研究表明，蝦源雷氏普羅威登斯菌對羧芐青霉素、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、鏈霉素等藥物敏感，但對新生霉素和紅霉素等耐藥。陳永林等[23]對白鰭鯊雷氏普羅威登斯菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示其對頭孢曲松、頭孢哌酮和諾氟沙星等抗生素敏感。李林俐等[8]對揚(yáng)子鱷雷氏普羅威登斯菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示其對頭孢噻肟、頭孢哌酮、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明等多種抗生素敏感。由此可見，人源雷氏普羅威登斯菌對喹諾酮類、碳青霉烯類等藥敏特性與水產(chǎn)動物源雷氏普羅威登斯菌存在明顯差異，這可能與菌株來源、地域分布和臨床用藥有關(guān)[8,24]。本研究中，對龜源雷氏普羅威登斯菌G0503菌株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明，該菌對頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等藥物敏感，對阿莫西林、氨芐西林、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明等耐藥。研究表明，水產(chǎn)動物雷氏普羅威登斯菌對頭孢菌素類、喹諾酮類及氟苯尼考等抗生素敏感[6,8]，這與本試驗中巴西龜雷氏普羅威登斯菌的藥敏試驗結(jié)果基本一致。以上研究報道了雷氏普羅威登斯菌藥敏特性，可為水產(chǎn)動物疾病防治提供參考依據(jù)。

4 結(jié)語

本研究中從患病巴西龜眼內(nèi)分離到1株雷氏普羅威登斯菌，藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌對頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等藥物敏感；人工回歸感染證實，該菌對巴西龜有致死性，并且導(dǎo)致眼瞼等組織病理變化。本研究結(jié)果不僅為龜類細(xì)菌性疾病防治提供科學(xué)依據(jù)，而且對雷氏普羅威登斯菌感染龜鱉類水生動物的致病機(jī)理研究進(jìn)行了有益的探索。