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      雷氏丹參片對斑馬魚腸下血管和節(jié)間血管損傷模型的保護作用

      2022-06-14 08:23:42李小雪蘇海波方延廷李屹龍俞佳利孫琳潔薛金貴
      中成藥 2022年4期
      關鍵詞:雷氏丹參片斑馬魚

      李小雪, 陳 昕, 蘇海波, 方延廷, 李屹龍, 俞佳利, 孫琳潔, 薛金貴*

      (1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院心內科,上海 201203;2.上海雷允上藥業(yè)有限公司,上海 201499)

      動脈粥樣硬化性心血管疾病是嚴重威脅人類健康的一類疾病,發(fā)病率和死亡率一直居高不下,給家庭和國家醫(yī)療衛(wèi)生帶來了沉重經濟負擔。雖然近些年來動脈粥樣硬化性心血管疾病的預防和治療已取得重大進展,但仍由許多動脈粥樣硬化性心血管疾病患者不適合有創(chuàng)性血運重建,或血運重建后存在殘余狹窄,迫切需要其它創(chuàng)新的治療方法加以補充[1]。治療性血管新生已被證明可以重建缺血心臟組織的血管,減少組織梗死的進展,并避免侵入性外科手術或組織/器官移植,是動脈粥樣硬化性心血管疾病患者治療的有益補充[2]。中藥丹參中含有的藥效成分是內皮細胞、血管平滑肌、心肌細胞和免疫細胞中許多受體的潛在靶點,通過影響細胞的增殖、分化、遷移或分泌,發(fā)揮預防、抑制早期事件以及改善動脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)展的作用[3-4]。本實驗研究雷氏丹參片在斑馬魚模型上促血管新生作用,為雷氏丹參片活血化瘀、改善微循環(huán)、保護內皮細胞等治療心腦血管病提供理論依據。

      1 材料

      1.1 動物 清潔級Tg(fli-1a:EGFP)y1斑馬魚、野生型斑馬魚,由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實驗室提供并飼養(yǎng),實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2018-0004。

      1.2 試劑與藥物 雷氏丹參片浸膏粉(上海雷允上藥業(yè)有限公司,批號180718),1 g雷氏丹參片浸膏粉相當于1.10~1.16 g生藥量。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;內皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(endothelial cell growth receptor tyrosine kinase inhibitorⅡ,VRI)(美國Selleck公司, 批號S1040);TRIpure(批號1166716500)、cDNA合成試劑盒(批號4897030001)、SYBR Green Master(批號4913914001)均購自上海羅氏制藥有限公司。

      1.3 儀器 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展有限公司);熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司);熒光定量PCR儀(上海羅氏公司);多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

      2 方法

      2.1 雷氏丹參片毒性實驗 使用正常健康受精24 h的野生型斑馬魚,放入每孔含1 mL飼養(yǎng)液的24孔板中,每組10條。用胚胎培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片,制成質量濃度為0.1、1、3、10、30、100、300 μg/mL的混懸液,分別加入24孔板中,于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以僅加培養(yǎng)液組為空白對照組,培養(yǎng)5 d,每天定時使用熒光倒置顯微鏡下拍照觀察斑馬魚的狀態(tài)并記錄。

      2.2 雷氏丹參片干預斑馬魚腸下血管新生實驗 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a:EGFP)y1斑馬魚,鑷子除去胚胎軟殼,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組2個復孔。用胚胎培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片至3、10、30、100 μg/mL,作為加藥組,以僅加培養(yǎng)液組為空白對照組,放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸棄舊培養(yǎng)液,重新加入培養(yǎng)液和不同質量濃度的雷氏丹參片,培養(yǎng)48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察雷氏丹參片在不同質量濃度下對斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)的影響。斑馬魚腸下血管出芽數(shù)=血管出芽數(shù)×1,斑馬魚腸下血管交叉數(shù)=血管交叉數(shù)×1。

      2.3 雷氏丹參片干預VRI誘導斑馬魚腸下血管損傷實驗 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a:EGFP)y1斑馬魚幼魚,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組3個復孔。以100 nmol/L VRI為培養(yǎng)液,然后用培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片質量濃度為3、10、30、100 μg/mL,為加藥組,放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中,以不加VRI的培養(yǎng)液組為空白對照組,藥物干預24 h后觀察雷氏丹參片在對斑馬魚SIVs的影響。

      2.4 雷氏丹參片干預VRI誘導斑馬魚節(jié)間血管損傷實驗 使用正常健康受精24 h的Tg(fli-1a:EGFP)y1斑馬魚幼魚,將其飼養(yǎng)于24孔板中,每孔8條,每組2個復孔。按“2.3”項下方法分組,藥物干預24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察雷氏丹參片在對斑馬魚節(jié)間血管的影響。斑馬魚節(jié)間血管統(tǒng)計方法=完整血管數(shù)×1+不完整血管數(shù)×0.5。

      2.5 實時熒光定量PCR法檢測斑馬魚體內mRNA的表達 選擇正常健康受精24 h的斑馬魚幼魚,飼養(yǎng)于24孔板中,每組12條,分為空白對照組、模型組、VRI+雷氏丹參片組和雷氏丹參片組,以100 nmol/L VRI為培養(yǎng)液,然后用培養(yǎng)液稀釋雷氏丹參片質量濃度為100 μg/mL。藥物作用24 h后,使用TRIpure提取各組斑馬魚總RNA,轉錄因子cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA作為模板,SYBR Green Master進行定量PCR。擴增條件為95 ℃預變性10 min;95 ℃變性20 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40個循環(huán)。檢測VEGF、flt-l、kdr、kdrlmRNA表達,以GAPDH為內參基因,2-△△CT法計算相對表達,引物序列見表1。

      表1 引物序列

      3 結果

      3.1 雷氏丹參片對斑馬魚生存率的影響 使用不同質量濃度雷氏丹參片進行培養(yǎng),當質量濃度達到300 μg/mL時,培養(yǎng)到第3天后斑馬魚開始出現(xiàn)死亡,到第5天全部死亡,其他質量濃度斑馬魚正常存活,說明雷氏丹參片的安全劑量為100 μg/mL及100 μg/mL以下,見圖1。

      3.2 雷氏丹參片對正常斑馬魚腸下血管的影響 與空白對照組比較,各劑量雷氏丹參片組出芽數(shù)和交叉點均無明顯變化(P>0.05);各劑量雷氏丹參片可促進斑馬魚直徑生長(P<0.05),見圖2、表2~3。

      圖2 雷氏丹參片對正常斑馬魚腸下血管的影響(×4.5)

      表2 雷氏丹參片對正常斑馬魚腸下血管直徑的影響

      3.3 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚腸下血管生長障礙的影響 與空白對照組比較,模型組斑馬魚腸下血管出芽數(shù)及直徑無明顯變化(P>0.05),交叉點數(shù)減少(P<0.05);與模型組比較,各劑量雷氏丹參片組斑馬魚腸下血管出芽數(shù)無明顯變化(P>0.05),交叉點數(shù)和直徑增加(P<0.05),見圖3、表4~5。

      圖3 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚腸下血管生長障礙的影響(×4.5)

      表3 雷氏丹參片對正常斑馬魚腸下血管出芽數(shù)和交叉點的影響[M(QL,QU)]

      表4 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚腸下血管直徑的影響

      3.4 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響 與空白對照組比較,模型組和0.1 μg/mL雷氏丹參片組斑馬魚節(jié)間血管直徑減少(P<0.01),1、10、100 μg/mL雷氏丹參片組無明顯變化(P>0.05);與模型組比較,1、10、100 μg/mL雷氏丹參片組斑馬魚節(jié)間血管直徑增加(P<0.01),0.1 μg/mL雷氏丹參片組無明顯變化(P>0.05),見圖4~5。

      圖4 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響(×4.5)

      表5 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚腸下血管出芽數(shù)和交叉點的影響[M(QL,QU)]

      3.5 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚中VEGF及其受體表達的影響 與空白對照組比較,模型組斑馬魚中kdr、flt-1 mRNA表達降低(P<0.05);與模型組比較, VRI+雷氏丹參片組和雷氏丹參片組斑馬魚中kdr、flt-1 mRNA表達均升高(P<0.01),VRI+雷氏丹參片組斑馬魚中VEGF、kdrlmRNA表達無明顯變化(P>0.05),雷氏丹參片組斑馬魚中kdrlmRNA表達升高(P<0.05),見圖6。

      注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01; 與模型組比較,##P<0.01。圖5 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚節(jié)間血管生長障礙的影響

      注:與空白對照組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。圖6 雷氏丹參片對VRI抑制斑馬魚VEGF、kdrl、kdr、flt-1 mRNA表達的影響

      4 討論

      血管新生作為冠心病的內科治療手段,已成為治療冠心病的一種可能,并在心血管疾病中表現(xiàn)出了積極的治療作用[5]。斑馬魚作為一種整體動物模型,基于其成本低廉、與人類基因同源性高、方便快速篩選等特點,已成為心血管研究領域的理想動物模型[6]。丹參作為傳統(tǒng)中藥,其有效成分具有抗凝血、擴張冠狀動脈、改善微循環(huán)等多種藥理作用,被廣泛用于治療心血管疾病,包括心肌梗死、心絞痛和動脈粥樣硬化等,能夠改善患者的臨床癥狀[7-9]。丹參及其成分參與調控血管新生, 徐杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)丹參水溶性有效成分丹參多酚酸鹽,能夠促進單核細胞誘導的內皮細胞遷移,并促進單核細胞合成和分泌VEGF、bFGF。丹參素可增強缺血后的新生血管形成,以及血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子標記蛋白的表達[11]。丹酚酸B可增加心肌組織VEGF、Nrf2和HO-1的表達促進大鼠缺血心肌血管再生[12]。丹參酮ⅡA可通過VEGF信號通路在缺血性斑馬魚模型中發(fā)揮促血管新生和血管保護作用[13]。雷氏丹參片采取水、醇雙提取工藝,提取其水溶性的丹參酚酸類和脂溶性的丹參酮類成分, 在臨床冠心病心絞痛患者的治療中具有顯著療效[14],張春伶等[15]系統(tǒng)分析聯(lián)合雷氏丹參片治療冠心病安全有效, 且具有調節(jié)血脂的作用,但是關于雷氏丹參片治療冠心病的具體作用機制的研究仍較缺乏。

      本實驗以中醫(yī)理論為指導,研究雷氏丹參片在斑馬魚模型上的促血管新生作用及其作用機制,發(fā)現(xiàn)雷氏丹參片質量濃度在100 μg/mL及100 μg/mL以下是安全可靠的;雷氏丹參片可以促進斑馬魚腸下血管的生長,斑馬魚腸下血管的出芽數(shù)和直徑均增加,具有促進血管新生的作用,不管是新生毛細血管的數(shù)量還是管腔直徑均增加;在藥物抑制血管生長模型中,加入雷氏丹參片后斑馬魚腸下血管交叉點的數(shù)量增加;對于斑馬魚節(jié)間血管生成不足的模型,給予不同質量濃度丹參片,均能夠促進斑馬魚節(jié)間血管的生長。本實驗結果表明,在一定條件下,雷氏丹參片對受損血管具有修復與保護作用。對斑馬魚體內VEGF受體檢測結果顯示,雷氏丹參片組和VRI+雷氏丹參片組均表現(xiàn)了對flt1、kdr、kdrl的促表達作用,說明雷氏丹參片促血管新生作用,可能與干預VEGF/VEGFR信號通路有關。

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