何微 岳苑 賈冰凝

摘 要：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測技術(shù)已成為現(xiàn)代食品檢測行業(yè)中的重要分支。近些年我國對食品的質(zhì)量愈發(fā)重視，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)憑借著其高效、迅速、精準(zhǔn)的優(yōu)勢已成為食品安全檢測技術(shù)中的中流砥柱，進(jìn)入了新階段。本文對食品檢測中實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的安全隱患進(jìn)行了分析與總結(jié)，提出了有效的管理對策，確保了檢測環(huán)境與數(shù)據(jù)的安全。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)檢測技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)室安全

中圖分類號：TS20 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）04（b）-0133-03

眾多數(shù)據(jù)顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由于其不可替代的優(yōu)點(diǎn)，加之近年來各地科技攻關(guān)均把醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域中的食品安全作為重要的優(yōu)先研究領(lǐng)域，因此該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類食品的微生物檢測、動物源性食品摻假技術(shù)的檢測以及食品的轉(zhuǎn)基因狀況檢測等等。大量研究表明微生物與分子生物學(xué)檢測技術(shù)是食品中致病菌以及摻假情況檢測的基礎(chǔ)和支撐。黨的十八大之后，國家食品藥品監(jiān)督管理總局對食品檢測領(lǐng)域不斷進(jìn)行擴(kuò)項(xiàng)，使得各檢測機(jī)構(gòu)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在改進(jìn)檢測技術(shù)，優(yōu)化檢測方法的同時(shí)也不斷擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，完善檢測的硬件設(shè)施，但也因此加大了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理難度。分子實(shí)驗(yàn)室在給我們檢測提供便捷的同時(shí)，其中所包含的高毒、易燃、易爆、強(qiáng)氧化物質(zhì)[1]也給我的檢測工作帶來了困擾，近期不斷報(bào)道的各類生物安全事故[2]，更警示著我們實(shí)驗(yàn)室安全不可松懈。

本文通過介紹近年來實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，并總結(jié)近年來國內(nèi)外生物實(shí)驗(yàn)室發(fā)生的安全事故，針對具體檢測情況，探究子分生物實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)具備的安全管理準(zhǔn)則。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概括

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理

PCR反應(yīng)技術(shù)是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的原理在體外促和成特異DNA片段的一種方法[1]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)則是根據(jù)所添加的熒光基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光信號的變化實(shí)監(jiān)測每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，具體檢測過程中的定量分析是根據(jù)循環(huán)閾值（Ct）和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析進(jìn)行的。根據(jù)不同的熒光標(biāo)記類型可以將RT-PCR技術(shù)分為探針類和非探針類，研究表明，探針類標(biāo)記的特異性更高，應(yīng)用更廣。

1.2 非探針類法（熒光染色法）

眾多的熒光染料中SYBR Green1由于其操作簡單（無須脫色或沖洗），染色的凝膠樣品熒光信號強(qiáng)，背景信號低，因此是應(yīng)用最為廣泛的。有數(shù)據(jù)表明熒光染色法至少可檢出20pg DNA，這高于EB染色法的25～100倍。此外還有LC Green TM1和Pico Green等新型熒光染料，當(dāng)PCR擴(kuò)增的時(shí)候，所添加的染料結(jié)合到DNA上[3]，則會產(chǎn)生熒光信號，便于研究者的有效收集。但實(shí)踐證明，染料法雖然成本低，可其特異性不強(qiáng)，他會與所有的雙鏈的DNA相結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，這大大降低了熒光染色法的檢測精度[4]。

1.3 熒光探針法

探針法則避開了熒光染色法的不足，在對模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除引物外再添加一個(gè)特異性的探針，此探針的兩端具有發(fā)光和淬滅兩個(gè)基團(tuán)，當(dāng)DNA通過引物進(jìn)行合成的時(shí)，探針折斷，其兩端的基團(tuán)均被釋放，此時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過收集發(fā)光基團(tuán)產(chǎn)生熒光，從而對檢測基因進(jìn)行定量[5]。目前食品檢測過程中應(yīng)用最多的為TaqMan探針技術(shù)[6]，在擴(kuò)增過程中，每一次模板的復(fù)制就伴隨著一個(gè)探針的斷裂，并同時(shí)釋放一個(gè)熒光信號，隨著產(chǎn)物的增加，熒光信號也跟著不斷加強(qiáng)，將不同的模板擴(kuò)增的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)模板數(shù)的對數(shù)值擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而準(zhǔn)確推斷出起始模板的數(shù)量。

除此之外，我們還有ScorpionsTM/AmplifluorTM （雜交探針）、LUX（雜交探針）、Universal probe library-LNA （ locked nucleic acids水解探針）、Simple probe探針、Dual-oligo FRET pairs（雙雜交探針）等探針技術(shù)[7]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在食品檢測方面的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)有效減少擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染[8]，加之其可以直接定量，查看濃度，這就避免了傳統(tǒng)PCR檢測時(shí)所需的電泳及相關(guān)色劑對檢測人員造成傷害。因此該檢測方法被廣泛應(yīng)用在對食品中的致病菌進(jìn)行檢測的環(huán)節(jié)中[9]，相比較傳統(tǒng)的按部就班的微生物檢測辦法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法更為快速、敏感[10]。

轉(zhuǎn)基因食品近年發(fā)展十分迅速，但其所產(chǎn)生的食品安全性問題也成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著人們食品安全需求的日益增加，目前對食品轉(zhuǎn)基因檢測已從定性提高到定量水平。當(dāng)前對轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)路線主要有兩條：一是對外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測；二是直接檢測外源基因DNA。與此同時(shí)，熒光定量PCR技術(shù)還可應(yīng)用于食品中摻假問題的檢查。

以上種種表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在檢驗(yàn)過程中必不可少，因此為了保障工作的順利開展，我們不僅要熟練掌握分子檢測技術(shù)，更應(yīng)保障分子實(shí)驗(yàn)室的安全。

2 分子實(shí)驗(yàn)室的安全

2.1 分子實(shí)驗(yàn)室安全隱患分析

根據(jù)國內(nèi)外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全事故的報(bào)道[11]，本文將分子安全隱患主要?dú)w結(jié)為以下幾個(gè)方面。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)試劑及檢驗(yàn)廢棄物

日常食品的微生物和分子生物學(xué)檢驗(yàn)過程中因?yàn)樯婕暗骄|(zhì)、稀釋、培養(yǎng)、擴(kuò)增等步驟，因此常常會產(chǎn)生一些廢液、培養(yǎng)物及固體廢棄物等，其中很多廢棄物具有生物安全隱患[12]；其尤其是利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對食品中的微生物進(jìn)行快速檢測時(shí)，很容易造成各類致病菌及組織樣品的污染，這類污染物具有一定的傳染性，倘若處理不當(dāng)會不僅會造成檢驗(yàn)室的污染，影響今后的檢測結(jié)果；更會對實(shí)驗(yàn)人員的身體健康造成傷害。另外檢測中所用部分生物試劑也會對檢驗(yàn)員造成潛在的危害，如若細(xì)胞裂解液、各類酶、溴化乙錠染色液以及各類模板及其所對應(yīng)的引物和探針等具有一定的致癌性和毒性[13]。

2.1.2 易造成事故的儀器設(shè)備

食品檢測分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中有很多專用檢驗(yàn)設(shè)備，較為常見的有高壓滅菌鍋、干熱加熱器、均質(zhì)器、液氮鋼瓶、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀等設(shè)備[14]，具體操作時(shí)必須嚴(yán)格按照規(guī)定要求進(jìn)行使用，否則會造成嚴(yán)重的后果。此外，某些大功率儀器設(shè)備使用時(shí)發(fā)生故障，有可能會引起電力故障甚至火災(zāi)，尤其是高壓滅菌鍋，使用時(shí)輕則燙傷，重則爆炸；因此一定要注意防護(hù)。

為了確保日常檢測工作的順利開展我們一定要做到防患于未然，不僅需要注意熒光定量PCR等大型儀器的期間核查和校準(zhǔn)，還需要注意實(shí)驗(yàn)室安全維護(hù)。

3 食品檢測分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的管理

3.1 分子實(shí)驗(yàn)室的功能區(qū)域的設(shè)立及相應(yīng)的衛(wèi)生管理措施

根據(jù)各單位具體的檢測需要，食品檢測分子生物學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室可以劃分為RNA（DNA）提取專區(qū)、體系配置及核酸濃度檢查區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)、滅菌區(qū)等區(qū)域。各區(qū)域之間通過傳遞窗傳遞物品，傳遞窗中安裝紫外燈，做好了隔離措施，從以確保降低實(shí)驗(yàn)室污染、減少安全事故的發(fā)生。

此外在實(shí)驗(yàn)室日常管理中，嚴(yán)格實(shí)行專人專責(zé)，注意日常檢測工作中儀器的期間核查、維護(hù)保養(yǎng)、水電安全、衛(wèi)生消毒效果等的監(jiān)測，對于大型儀器及危險(xiǎn)系數(shù)較高的儀器，如高壓滅菌鍋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等使用前必須安排人員進(jìn)行學(xué)習(xí)，考核合格后方可上崗，并定期做好檢驗(yàn)人員的持續(xù)能力評價(jià)工作。

3.2 嚴(yán)格加強(qiáng)生物試劑的管理

食品檢測過程中所需使用的生物試劑的管理是每個(gè)檢測機(jī)構(gòu)中分子生物實(shí)驗(yàn)室管理的重要部分，特別是危險(xiǎn)試劑的管理。因此必須從試劑的購買申請、采購、驗(yàn)收、儲存、管理、使用、無害化處理等全過程加強(qiáng)規(guī)范管理[15]。對于劇毒試劑（如EB染料）、易燃（如酒精）、易爆品（如液氮等）以及試驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)菌株的購買均得交單位審批后方可購買。在實(shí)驗(yàn)室中，各類試劑及培養(yǎng)基均需做好嚴(yán)格的分類擺放，對于標(biāo)準(zhǔn)菌株的管理需嚴(yán)格實(shí)行雙人雙鎖管理制度，并要求填寫領(lǐng)用登記單，以及相關(guān)入庫表。

3.3 生物廢棄物管理

對于分子實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生廢棄物（如帽子、口罩、手套、槍頭、DNA提取物、擴(kuò)增產(chǎn)物等），嚴(yán)格按照操作流程實(shí)行，絕不隨意放置，分子檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定明顯的實(shí)驗(yàn)廢棄物回收點(diǎn)，嚴(yán)禁把實(shí)驗(yàn)廢棄物和普通生活垃圾混放，對于產(chǎn)生的廢棄物必須進(jìn)行無害化處理后才能傾倒或填埋，及時(shí)做好污染物處理記錄，并且定期采用生物（化學(xué)）監(jiān)測檢測滅菌及無害化處理效果。

4 未來展望

近幾年來，各地的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量呈逐年增加的趨勢，而有關(guān)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對食品進(jìn)行快速檢測的地方標(biāo)準(zhǔn)也層不不窮，與此同時(shí)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)更為廣泛的被應(yīng)用，檢驗(yàn)過程中的易制毒化學(xué)品的使用數(shù)量亦在不斷增加，因此迫切需要各單位對易制毒化學(xué)品進(jìn)行規(guī)范管理，并在管理方式上進(jìn)行創(chuàng)新；在提升檢測技術(shù)，優(yōu)化檢測方法的同時(shí)，也要多借鑒他人的成功之處，在此基礎(chǔ)上，形成本單位更為有效的分子實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)范管理體系，使得檢測和管理每一個(gè)環(huán)節(jié)無懈可擊。通過單位各部門的充分合作，確保檢測工作更順利的開展 。

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