王欣

【摘 要】目的：本實(shí)驗(yàn)選用肺炎鏈球菌為研究目標(biāo)，為基礎(chǔ)研究提供相對(duì)應(yīng)的方法參考。方法：簡(jiǎn)述肺炎鏈球菌的復(fù)蘇，傳代，凍存的方法，繪制肺炎鏈球菌生長(zhǎng)曲線，通過(guò)革蘭氏染色和奧普托欣（ Optochin）實(shí)驗(yàn)對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。結(jié)果：經(jīng)不同時(shí)間段對(duì)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，16h左右為菌液最大濃度期，Optochin實(shí)驗(yàn)抑菌環(huán)為22.3mm±2.1mm。結(jié)論：可根據(jù)本論文的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行基礎(chǔ)研究，結(jié)果可進(jìn)行參考。

【關(guān)鍵詞】肺炎鏈球菌；生長(zhǎng)曲線；鑒定方法

【中圖分類號(hào)】R365 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）10-222-01

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落類似圓球狀，并持有α溶血環(huán)。其廣泛分布于自然界中，為條件致病菌，是呼吸道感染的常見病原菌之一[1]。作為引起慢性支氣管炎急性發(fā)作和社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌[2]，肺炎鏈球菌一直是眾學(xué)者研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)對(duì)其特性及生長(zhǎng)曲線進(jìn)行研究，為基礎(chǔ)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料及相關(guān)儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 肺炎鏈球菌菌種（購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC編號(hào)：10913）

1.2 藥物與試劑 血平皿：鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司，批號(hào) 150928-2；奧撲托新（Optochin）藥敏片：5μg，6.35mm，20片，康泰生物，批號(hào)0C05；牛肉粉：北京奧勃星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)12012； 氯化鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20140510；蛋白胨：北京奧勃星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)11001；草酸銨：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)140410；結(jié)晶紫：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)141002；蕃紅液：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)150503；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)121112。

1.4 主要儀器 SorvaⅡ ST16低溫離心機(jī)（Thermo公司），4-1生物顯微鏡（OLYMPUS 日本）；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；MDF-382E -80℃低溫冰箱（日本三洋公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配置 肺炎鏈球菌液體培養(yǎng)基的配制：

蛋白胨：1.0g；牛肉膏：0.3g；氯化鈉：0.5g，以上粉末充分溶于95ml無(wú)菌水中，混勻后將PH值調(diào)至7.2-7.4左右，高壓滅菌后冷卻。冷卻后的培養(yǎng)基與胎牛血清按：胎牛血清：5ml，培養(yǎng)基95ml比例混合，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.2.1 肺炎鏈球菌的復(fù)蘇及培養(yǎng) 凍干粉：生物安全柜紫外消毒30min，取出肺炎鏈球菌菌種凍干粉，用0.5ml滅菌雙蒸水稀釋干粉，接種于兩個(gè)血平板上，每個(gè)0.25ml，用接種環(huán)均勻涂抹整板即可。37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)

凍存管：從-80℃冰箱或液氮中取出菌種后，37℃水浴鍋快速溶解后，無(wú)菌生物安全柜內(nèi)取0.25ml內(nèi)用接種環(huán)均勻涂抹整板即可。37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2.2 肺炎鏈球菌的傳代及凍存 傳代：接種環(huán)取出培養(yǎng)成熟的一環(huán)菌，用三區(qū)劃線法傳代于血平板上。培養(yǎng)成熟的菌可放于4℃冰箱備用，但時(shí)間不可超過(guò)3天。

凍存：將活化3代的菌接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后4℃，6000轉(zhuǎn)離心，棄上清，用甘油與胎牛血清比例為2：8的1ml混合液體混勻沉淀，儲(chǔ)存于無(wú)菌凍存管中，凍存于-80℃冰箱或液氮。

2.2.3 肺炎鏈球菌CFU計(jì)數(shù) 即平板計(jì)數(shù)法。將菌液樣品用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，取合適的稀釋度（一般5個(gè)稀釋度），以涂布法接種于平板進(jìn)行操作，常選取菌落數(shù)為30-300之間的平板作為菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，每一稀釋度采用三個(gè)平板菌數(shù)的平均數(shù)，經(jīng)培養(yǎng)后，按照計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落，即

菌落濃度（cfu/ml）=3平板菌落計(jì)數(shù)平均值×10n（n=稀釋倍數(shù)）

2.2.4 肺炎鏈球菌生長(zhǎng)曲線的繪制 根據(jù)肺炎鏈球菌自溶特性，取1環(huán)菌培養(yǎng)在5ml培養(yǎng)基中，在不同時(shí)間點(diǎn)的進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，做出生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1及表1可見，肺炎鏈球菌在培養(yǎng)到16h-18h時(shí)左右時(shí)，菌量達(dá)到峰值，而后逐漸下降，在以下實(shí)驗(yàn)中均選擇培養(yǎng)時(shí)間為16-18小時(shí)左右。

2.3 肺炎鏈球菌菌種的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌落：灰色，半透明，光滑，扁平小菌落，培養(yǎng)20h以后周圍可見草綠色溶血環(huán)。

2.3.2 革蘭染色法 革蘭染色[3]：

涂片：用接種環(huán)從菌液中取出一環(huán)菌于載玻片中央涂成薄層即可，或先滴一滴無(wú)菌水于載玻片中央，用接種環(huán)從平板上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層；干燥：涂片后在室溫下自然干燥；固定：手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速移動(dòng)3-4次，共約3-4秒，要求玻片溫度不超過(guò)60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過(guò)燙為宜，放置待冷后染色；

染色：①初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約1分鐘水洗；②媒染：滴加碘液，沖去殘水，并覆蓋約1分鐘；③脫色：將載玻片水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20-30秒，立即用水沖凈酒精；④復(fù)染：用蕃紅液染1-2分鐘水洗鏡檢：干燥后，置油鏡觀察，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色

2.3.3 COptochin敏感試驗(yàn) 幾乎所有的肺炎鏈球菌對(duì)奧普托欣敏感，而其他鏈球菌耐藥。

4 討論

肺炎鏈球菌感染是由肺炎鏈球菌入侵機(jī)體而引發(fā)的感染性疾病，包括肺炎、敗血癥、腦膜炎及中耳炎等[4]。肺炎鏈球菌作為常見致病菌，可引起多種疾病，因此大量的研究人員進(jìn)行相關(guān)疾病的基礎(chǔ)及臨床研究。關(guān)于如何培養(yǎng)，在文獻(xiàn)中有大量相關(guān)報(bào)道，但大多一筆帶過(guò)，在實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)處往往不知所措。本論文作者在實(shí)驗(yàn)中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)分享給大家，希望對(duì)相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Cloutier MM， loughl ia GM.Chronic cough in children： A manif-estation of Airway hyperreactivity[J].1981， 67（1）： 6-12.

[2] 康悅，吳菊芳，黃海輝等.肺炎鏈球菌引起的社區(qū)獲得性肺炎及慢支急性加重患者的臨床特性分析[J].中國(guó)感染與化療雜志2011青年優(yōu)秀論文集，2011：207-210.

[3] 陳秀榮.革蘭染色實(shí)驗(yàn)教學(xué)體會(huì)[J].中國(guó)西部科技，2014，9：115.