微小核糖核酸-223-3p對(duì)心臟缺血/再灌注損傷后心臟重構(gòu)的影響

李蕓蕓 李玉琳 王綠婭 陳博雅 張聰聰 杜 杰

心臟重構(gòu)是很多心血管疾病的終末期變化,在此過(guò)程中心臟肥大、膠原增生和沉積、心臟纖維化，引起心臟收縮和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在心臟重構(gòu)中微小核糖核酸(micro-ribonucleic acids，miRNAs)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。miRNAs是一類由約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，一般與靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，通過(guò)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯來(lái)發(fā)揮作用[2]。miR-223能通過(guò)抑制肌鈣蛋白I磷酸化，減少心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而減輕心肌肥厚[3]。但miR-223在心臟缺血/再灌注損傷中對(duì)心臟重構(gòu)的作用并不十分清楚。因此，本研究旨在探討miR-223在心肌缺血/再灌注損傷中對(duì)心臟重構(gòu)的影響，對(duì)研究缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 隨機(jī)選取miR-223基因缺陷，雄性小鼠和C57BL/6J野生雄性小鼠，各9只，SPF級(jí)，8～10周齡，體質(zhì)量23～25g，列為兩組：①miR-223缺陷小鼠缺血/再灌注組(miR-223缺陷組)；②野生小鼠缺血/再灌注組(對(duì)照組)。由北京市華阜康生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房，清潔飲水和飲食。

2.復(fù)制小鼠心臟缺血/再灌注模型 用異氟烷麻醉小鼠后，在小鼠左側(cè)第3～4肋間剪開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離肌肉，迅速將心肌擠出，并于左心耳與動(dòng)脈圓錐交界下方約2mm處結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈前降支，再迅速將心臟放回心腔，復(fù)合肌肉，縫合皮膚[4]。心電圖儀觀測(cè)小鼠心電圖，若ST段升高則模型制作成功。結(jié)扎30min后，拔出結(jié)扎線恢復(fù)灌流。

3.主要儀器和試劑 ECLIPSE 90i顯微鏡(日本Nikon公司)，蠟塊包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)，NIS-Elements BR 3.0定量分析軟件。高內(nèi)涵熒光分析系統(tǒng)(Molecular Device公司)。DMED培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液、1×PBS、CellROX? Green Reagent(Life Technology公司)。LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑(Invitrogen公司)。miR-223 模擬物(miR-223 mimic)、模擬物陰性對(duì)照(mimic NC)(銳博公司)。

4.心臟取材 用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠后，剪開(kāi)小鼠胸腔，用0.9%氯化鈉溶液灌注心血管體循環(huán)系統(tǒng)，剪取小鼠心臟，將心臟浸泡于4%多聚甲醛8h，制作心臟石蠟切片。

5.心臟組織病理染色 采用Masson染色方法觀察心臟纖維化情況，染色程序及結(jié)果判定參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(邁新公司)。采用尼康電子顯微鏡(N90i)采集圖像，并使用NIS-Elements BR 3.0軟件進(jìn)行分析。

6.心肌細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧/復(fù)氧刺激 H9C2細(xì)胞(購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于10%DMED培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)中，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)48h。待細(xì)胞增殖狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成DMED培養(yǎng)基，并置于37℃缺氧箱中缺氧培養(yǎng)12h。缺氧完成后將培養(yǎng)基置換為10%DMED培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)24h，建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。

7.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 當(dāng)H9C2心肌細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，采用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑將50nmol/L的miR-223 mimic轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，并以mimic NC轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞作為對(duì)照。(轉(zhuǎn)染步驟見(jiàn)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書)

8.ROS檢測(cè) 將H9C2心肌細(xì)胞種于48孔板中，心肌缺氧/復(fù)氧刺激后，1XPBS清洗細(xì)胞，加入CellROX? Green Reagent(終濃度為5μM)37℃避光孵育30min，1XPBS清洗三次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，再用0.5% Triton? X-100 孵育10 min，最后用DAPI染細(xì)胞核。高內(nèi)涵熒光分析系統(tǒng)檢測(cè)ROS熒光，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485nm和 520nm。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用倍數(shù)或構(gòu)成比(%)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.miR-223基因缺陷加劇缺血/再灌心臟肥大 小鼠心臟缺血/再灌注28d后，稱量小鼠體質(zhì)量和心臟重量，測(cè)量小鼠脛骨長(zhǎng)度，計(jì)算心臟體質(zhì)量比和心臟脛骨長(zhǎng)度比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223缺陷小鼠心臟體質(zhì)量比和心臟重量脛骨長(zhǎng)度比均高于對(duì)照組(4.92±0.07)vs.(5.30±0.10)mg/g、(81.59±2.89)vs. (89.87±2.28)mg/cm(圖1)。

圖2 miR-223缺陷對(duì)缺血/再灌心臟纖維化的影響 A：對(duì)照組和miR-223缺陷組小鼠心臟進(jìn)行Masson染色(40X)，藍(lán)色染色為纖維化陽(yáng)性區(qū)域，紅色為正常心肌部分；B：統(tǒng)計(jì)心肌纖維化陽(yáng)性面積 (n=4)，注：兩組比較，*P<0.05

2．miR-223缺陷促進(jìn)缺血/再灌心臟纖維化 小鼠心臟缺血/再灌注28d后，Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，miR-223缺陷小鼠心臟纖維化增加，提示miR-223缺陷小鼠較對(duì)照組心臟纖維化加重[(5.16±2.11)vs. (13.19±1.96)%](圖2)。

3.miR-223 mimic轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞使其過(guò)表達(dá)miR-223 用miR-223 mimic轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞24h后，RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-223的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-223 mimic的心肌細(xì)胞中miR-223表達(dá)量升高218.59倍(圖3)。

4.心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-223減少缺氧/復(fù)氧刺激后ROS的產(chǎn)生 用miR-223 mimic轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞24h后，給予心肌缺氧/復(fù)氧刺激，24h后檢測(cè)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-223 mimic的心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧刺激后產(chǎn)生的ROS明顯減少[(22.42±0.78)vs.(18.62±0.62)%，圖4]。

圖1 miR-223缺陷對(duì)缺血/再灌心臟重構(gòu)的影響 A：游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠脛骨長(zhǎng)度，電子秤稱量心臟重量和小鼠體質(zhì)量，計(jì)算小鼠心臟重量與體質(zhì)量比；B：計(jì)算心臟重量與脛骨 長(zhǎng)度比(n=5)，注：兩組比較，*P<0.05

討 論

冠心病嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。根據(jù)冠心病治療指南，目前治療冠心病最有效的方法是通過(guò)溶栓、冠狀動(dòng)脈介入治療或者外科手術(shù)恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流[5]。雖然恢復(fù)缺血區(qū)域心肌的血流灌注能減少心肌梗死的發(fā)病率和死亡率，但是同時(shí)也會(huì)造成心肌細(xì)胞額外的損傷，這種損傷稱為缺血/再灌注損傷。缺血/再灌注損傷的機(jī)制包括：細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、氧自由基增多、鈣超載、能量代謝及炎癥反應(yīng)等[6]。心臟重構(gòu)是多種心血管疾病的終末期變化，在心臟缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的心力衰竭中發(fā)揮重要作用[1]。

圖3 miR-223 mimic轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞使其過(guò)表達(dá) miR-223(n=4)。注：兩組比較，**P<0.01

圖4 心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-223減少缺氧/復(fù)氧刺激后ROS的產(chǎn)生 A：將miR-223 mimic或mimic NC(轉(zhuǎn)染對(duì)照組)轉(zhuǎn)染入H9C2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后給予心肌缺氧/復(fù)氧刺激，24h后高內(nèi)涵熒光分析系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況(200X),綠色熒光為ROS,藍(lán)色熒光為細(xì)胞核；B：統(tǒng)計(jì)ROS陽(yáng)性細(xì)胞比 例(n=8)，注：兩組比較，**P<0.01

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與調(diào)節(jié)心臟重構(gòu)和心血管疾病。microRNA Let-7i能通過(guò)抑制靶基因白細(xì)胞介素-6和多種膠原蛋白的表達(dá)，減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng)和纖維化[7]?；罨木奘杉?xì)胞分泌富含miR-155的外泌體可以進(jìn)入心肌成纖維細(xì)胞，抑制成纖維細(xì)胞增殖并且促進(jìn)心臟炎癥反應(yīng)，從而加重心肌梗死導(dǎo)致的心臟損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，miR-223缺陷小鼠的心臟重量與體質(zhì)量比和心臟重量與脛骨長(zhǎng)度比明顯增高，心臟纖維化增加，提示miR-223可能加重心臟肥大和纖維化促進(jìn)心臟重構(gòu)。miR-223是造血細(xì)胞系特異性miRNA，主要由骨髓來(lái)源的血細(xì)胞合成，包括血液中的單核巨噬細(xì)胞、血小板等[9]，并且小鼠心臟缺血/再灌注損傷后心臟中miR-223表達(dá)增加，能減少心肌死亡[10]。缺血心肌恢復(fù)血流灌注后，會(huì)引發(fā)心肌炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞聚集。巨噬細(xì)胞在心臟疾病中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用可以促進(jìn)干擾素-γ表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的招募，心臟中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，加劇血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng)和纖維化[11]。巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)吞噬壞死心肌細(xì)胞碎片激活絲裂原活化激酶信號(hào)通路，放大炎癥反應(yīng)[12]。心肌梗死后，巨噬細(xì)胞細(xì)胞炎性蛋白-1α和β促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移并浸潤(rùn)心臟，誘導(dǎo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞形成，引起晚期心臟重構(gòu)[13]。此外，巨噬細(xì)胞還能促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1β的表達(dá)增加和Smad3磷酸化，最后加劇心臟纖維化[14]。而骨髓來(lái)源單核巨噬細(xì)胞能分泌miR-223[9]，并且人血清中miR-223含量與心肌梗死程度成負(fù)相關(guān)[15]。

缺血心肌恢復(fù)血流灌注可以引起組織或細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激與多種心血管疾病有著密切的關(guān)系，例如冠心病、原發(fā)性高血壓、心臟缺血/再灌注損傷、心房顫動(dòng)、心臟重構(gòu)和心肌病[16]。正常人體內(nèi)，氧化與抗氧化作用處于互相平衡狀態(tài)，多余的氧自由基會(huì)被及時(shí)清除掉，不會(huì)對(duì)人體組織和器官造成損傷。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞受到各種刺激導(dǎo)致體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化的作用紊亂，中性粒細(xì)胞及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，氧自由基增多或者清除能力下降，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)大量蓄積引起組織或細(xì)胞氧化損傷。在心臟重構(gòu)過(guò)程中，首先ROS廣泛激活心肌肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶和轉(zhuǎn)錄因子，包括酪氨酸激酶、Ras、 GTP結(jié)合蛋白、蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶；其次ROS通過(guò)誘導(dǎo)DNA、線粒體損傷和凋亡信號(hào)激酶的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是心臟重構(gòu)和功能障礙另一個(gè)重要原因；此外，ROS還能引DNA鏈斷裂，激活基質(zhì)金屬蛋白酶從而降解細(xì)胞外基質(zhì)[17]。氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷不容忽視，因此減少心肌氧化應(yīng)激損傷或許能成為減少心臟重構(gòu)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-223能抑制心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后活性氧自由基的產(chǎn)生，提示miR-223可能具有減少細(xì)胞氧化應(yīng)激的功能。

綜上所述，本研究表明miRNA-223可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激減輕心臟缺血/再灌注損傷后心臟重構(gòu)。提示miR-223作為調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要基因，可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激參與心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，為深入探討缺血/再灌注損傷所致的心臟重構(gòu)甚至心力衰竭的分子機(jī)制及防治策略提供新的靶點(diǎn)。