肺腺癌EGFR19及21外顯子基因型與18F-FDG攝取程度的關(guān)系研究

易婧薇 陳仰純 李凡勇 顧 霞 陳 萍

肺癌是當(dāng)前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤[1]，也是我國(guó)癌癥患者的頭號(hào)殺手。據(jù)《中國(guó)2011年惡性腫瘤登記年報(bào)》報(bào)告,2011年我國(guó)肺癌發(fā)病率為48.32/10萬(wàn),死亡率為39.27/10萬(wàn)[2]，青、中年人肺癌的發(fā)病亦不在少數(shù)[3]。隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)與癌癥發(fā)生機(jī)制的不斷深入研究,以阻斷腫瘤不受調(diào)控的信號(hào)通路和異常代謝過(guò)程為目標(biāo)的分子靶向治療在近年來(lái)得到快速發(fā)展。小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)通過(guò)抑制酪氨酸激酶磷酸化,能夠阻斷下游通路達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，其中EGFR基因19、21號(hào)外顯子突變提高腫瘤對(duì)TKI治療的敏感性,是選擇合適TKI治療患者的關(guān)鍵[4]。

最常用的 EGFR 基因突變檢測(cè)方法包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)直接測(cè)序法、基于即時(shí)PCR基礎(chǔ)的方法,如 Taq 法、ARMS 法等，然而無(wú)論哪種病理檢查方法, 有創(chuàng)性限制了其臨床應(yīng)用,尤其對(duì)于不愿或無(wú)法獲取組織病理的患者。

正電子發(fā)射體層顯像(positron emission tomography,PET)是是一種功能分子成像技術(shù),從分子水平顯示人體器官及組織細(xì)胞的代謝、功能、血流、細(xì)胞增殖和受體分布狀況。最常用的PET示蹤劑是葡萄糖的類(lèi)似物18F-FDG。 近年來(lái)一些學(xué)者探索用無(wú)創(chuàng)性分子影像學(xué)手段PET/CT來(lái)推測(cè)腫瘤是否具有EGFR突變以指導(dǎo)臨床治療。有作者認(rèn)為18F-FDG PET/CT顯像可以無(wú)創(chuàng)性預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR突變,但也有些研究持反對(duì)意見(jiàn)[5-8]。已有多項(xiàng)研究表明,原發(fā)灶的突變情況與轉(zhuǎn)移灶的突變情況存在不一致性[9-10],一些小標(biāo)本轉(zhuǎn)移灶的突變情況并不能真實(shí)反映原發(fā)灶的突變情況。此外,臨床亦有研究證明,對(duì)于可行手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌,原發(fā)灶的EGFR突變情況是預(yù)后良好的有效預(yù)測(cè)因子[11-12]。

基于上述已有研究的不足及早期檢測(cè)EGFR突變的臨床意義,本研究擬對(duì)完整手術(shù)切除的肺腺癌患者的原發(fā)灶按照2011 IASLC/ATS/ERS國(guó)際肺腺癌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),探討腺癌各亞型原發(fā)灶EGFR基因突變情況與18F-FDG的攝取關(guān)系，以期更加明確二者的關(guān)系。

材料與方法

1.研究對(duì)象 2009年1月至2012年4月，在我院PET/CT中心行PET/CT檢查的連續(xù)肺癌患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①行PET/CT檢查前未接受過(guò)手術(shù)、化療、放療或分子靶向治療的患者; ②通過(guò)手術(shù)得到明確病理學(xué)診斷;③同期在本院病理科或轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室行原發(fā)灶EGFR突變檢測(cè)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①最大腫瘤直徑<1.2cm者共9例，最后納入的患者共79例,男性42例，女性37性，年齡 31～82 歲,中位年齡62歲。所有患者均行肺癌切除術(shù),并有詳細(xì)手術(shù)記錄、病理結(jié)果和分期。所有患者檢查前均簽署知情同意書(shū),本研究屬回顧性研究,故無(wú)需經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.PET/CT顯像 PET/CT系GE公司產(chǎn)品,型號(hào)為Discovery ST8。PET儀為 24環(huán),層厚3.75mm,CT為L(zhǎng)ight speed 8排螺旋CT。顯像劑為18F-FDG,由本科室加速器(GE公司MINITrace型)生產(chǎn)，pH值約為7, 放化純度>95%?；颊邫z查前空腹4～6h。將血糖控制在正常水平(<11.2mmol/L),注射顯像劑前安靜、避光、平臥20min后靜脈注射18F-FDG 3.70～5.55MBq/kg?；颊哽o臥40～ 60 min,顯像前排盡尿液。先行螺旋CT掃描,掃描范圍為顱頂至股骨中段;掃描條件為:管電壓140kV,管電流120 mA,層厚3.75mm,螺距0.875, 矩陣512×512。在同一范圍PET發(fā)射掃描,采用二維模式,矩陣128×128,采集6～7個(gè)床位,采集時(shí)間3.5min/床位。對(duì)診斷疑問(wèn)的患者掃描后行胸部屏氣診斷性CT平掃,參數(shù)為120kV, 205mA,層厚1.25mm。PET圖像重建采用有序子集最大期望值迭代法(OS-EM)，CT重建采用標(biāo)準(zhǔn)重建法,重建層厚為3.75mm。

3.圖像分析 測(cè)量原發(fā)灶的最大標(biāo)準(zhǔn)化取值(SUVmax)以及 3個(gè)包含最大SUV的同樣大小ROI的平均SUV(SUVmean)。以GE Xeleris工作站自動(dòng)勾畫(huà)感興趣區(qū)(region of interest,ROI),計(jì)算平均SUVmean時(shí)ROI取大小為1.2cm×1.2cm的圓形感興趣區(qū)。

4.肺腺癌病理分類(lèi) 由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科高年資醫(yī)生按照2011 IASLC/ATS/ERS肺腺癌的國(guó)際多學(xué)科分類(lèi)[13]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有診斷為腺癌的病理片重新分類(lèi)。

5.EGFR基因突變檢測(cè) 檢測(cè)標(biāo)本取自患者手術(shù)切除標(biāo)本的石蠟組織標(biāo)本,采用Taqman-PCR法(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法))或ARMS-PCR法(廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司提供人類(lèi)EGFR基因21種突變檢測(cè)熒光PCR試劑盒)對(duì)EGFR基因19及21號(hào)外顯子進(jìn)行突變檢測(cè)。檢測(cè)儀器:BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用IBM SPSS20.0統(tǒng)計(jì)處理軟件。 對(duì)所有計(jì)量資料首先應(yīng)用Shapiro- Wilk方法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)記錄。不同EGFR狀態(tài)原發(fā)灶SUV、腺癌各亞型SUV、不同突變?nèi)旧wSUV的比較,經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用協(xié)方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.患者臨床與腫瘤特征 79例患者，原發(fā)灶的EGFR基因突變率為49.2%(共40個(gè)突變，其中19號(hào)外顯子缺失突變19個(gè)，21號(hào)外顯子突變20個(gè)(其中L858R點(diǎn)突變19個(gè)，L861Q點(diǎn)突變1個(gè))，1例患者同時(shí)具有19號(hào)外顯子缺失及21號(hào)外顯子L858R的點(diǎn)突變)?；颊咭话闾卣饕?jiàn)表1。

2.不同基因狀態(tài)的肺腺癌原發(fā)灶SUV比較野生型EGFR原發(fā)灶的平均SUVmax為9.56±7.96，SUVmean為7.68±4.32；突變型EGFR原發(fā)灶的平均SUVmax為8.92±5.92，SUVmean為5.78±2.32。EGFR突變型與野生型的SUVmax、SUVmean差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.688，0.324)。

3.肺腺癌各亞型 SUV 及不同亞型下不同突變狀態(tài)原發(fā)灶SUV的比較 根據(jù)2011IASLC/ATS/ERS腺癌分型，共獲得6個(gè)亞型,其中微小浸潤(rùn)型1例,貼壁生長(zhǎng)為主型8例,腺泡樣生長(zhǎng)為主型41例,乳頭狀生長(zhǎng)為主型11例,實(shí)體生長(zhǎng)為主型9例,浸潤(rùn)性粘液腺癌9例?？紤]腫瘤大小對(duì)原發(fā)灶SUV存在影響(F=39.128，P<0.001)，將SUVmax及SUVmean做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，分別將病灶Ln SUVmax 及Ln SUVmean 作為因變量,腺癌各亞型與基因突變狀態(tài)作為固定因子,將大小作為協(xié)變量,消除協(xié)變量影響后,腺癌亞型間修正Ln SUVmax、LnSUVmean 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖1)。各亞型不同突變狀態(tài)對(duì)LnSUVmax、LnSUVmean的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.329,P=0.132;F=1.183,P=0.281)。

表1 患者及腫瘤一般特征與EGFR19、21外顯子突變率的關(guān)系[n(%)]

表2 腺癌各亞型

圖1 腺癌不同亞型LnSUV的比較

討 論

2004年,Lynch等多位學(xué)者相繼證實(shí)了EGFR基因突變與TKIs靶向治療敏感性的關(guān)系,揭開(kāi)了TKIs廣泛應(yīng)用于肺癌治療的序幕[4]。近幾年已有數(shù)位學(xué)者研究了原發(fā)灶18F-FDG攝取與EGFR基因突變的關(guān)系,以期PET/CT能夠成為EGFR突變檢測(cè)方法的一種補(bǔ)充手段，然而研究結(jié)果卻至今眾說(shuō)紛紜。 Huang和Ko等學(xué)者認(rèn)為病灶的SUV越高,患者越容易發(fā)生EGFR基因突變[14-15]；而另一些學(xué)者則認(rèn)為突變型腫瘤的原發(fā)灶SUVmax明顯低于野生型病灶[16-17]；Lee等分析了206例患者的EGFR及KRAS基因型與FDG的攝取，認(rèn)為FDG無(wú)益于預(yù)測(cè)兩種基因的基因型[6]。本研究以79例腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本為檢測(cè)樣本, 在消除大小對(duì)SUV的影響后,雖然EGFR突變型的原發(fā)灶的SUV略低于野生型，但二者并差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Lee的研究結(jié)果一致。

2011年4月，國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)會(huì)(IASLC/ATS/ERS)聯(lián)合共同發(fā)起了國(guó)際多學(xué)科分類(lèi)，并被WHO延續(xù)采納為2015年腺癌病理分型。該分類(lèi)將手術(shù)切除標(biāo)本腺癌分為浸潤(rùn)前、微浸潤(rùn)、浸潤(rùn)型、浸潤(rùn)型腺癌變異型4個(gè)大類(lèi)，浸潤(rùn)前病變包括非典型樣腺瘤樣增生及原位腺癌；浸潤(rùn)型腺癌又根據(jù)形態(tài)分為伏壁樣生長(zhǎng)為主、腺泡樣為主、乳頭狀為主、微小乳頭狀為主以及實(shí)體型為主伴粘蛋白分泌；浸潤(rùn)型腺癌變異型分為浸潤(rùn)型粘液腺癌、膠質(zhì)樣腺癌、胎兒型腺癌、腸腺癌[13]。

新的分類(lèi)為腺癌的治療、預(yù)后提供了新的視角。治療方面，TKIs的使用是腺癌的一大突破，新的分類(lèi)指出EGFR突變主要與組織學(xué)上呈現(xiàn)的AIS、LPA(伏壁式或鱗屑樣生長(zhǎng)為主的腺癌)、乳頭狀或微乳頭狀腺癌相關(guān)[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體為主型腺癌、浸潤(rùn)性粘液腺癌及非腺癌的突變率明顯低于腺泡為主型、貼壁生長(zhǎng)為主型浸潤(rùn)性腺癌與微小浸潤(rùn)性腺癌，其中8例浸潤(rùn)性粘液腺癌無(wú)一例突變，但腺泡為主型浸潤(rùn)性腺癌與微小浸潤(rùn)、貼壁生長(zhǎng)為主型腺癌的突變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能與后者病理相對(duì)較少有關(guān)。我們檢測(cè)了各亞型不同EGFR狀態(tài)的原發(fā)灶糖代謝的高低，以期能夠通過(guò)結(jié)合病理亞型與原發(fā)灶糖代謝的情況對(duì)EGFR突變做以預(yù)測(cè)，然而遺憾的是，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前關(guān)于腫瘤糖代謝與基因突變的關(guān)系研究尚不成熟。通常認(rèn)為, EGFR基因的突變會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度激活,而PI3K通路中的PKB蛋白可以增加GLUT-4的表達(dá),從而細(xì)胞膜上的葡萄糖表達(dá)增加[18],而腫瘤FDG的攝取機(jī)制與GLUT-1的表達(dá)密切相關(guān)。另外,目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)關(guān)于由PKB引起的GLUT-4表達(dá)增加的定量研究,GLUT-4增加所引起的葡萄糖攝取增加能否達(dá)到影像學(xué)檢測(cè)的最低細(xì)胞數(shù)目需要進(jìn)一步研究。張亞銳等學(xué)者根據(jù)Inman及Zhang等對(duì)血小板分離出的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可以促進(jìn)細(xì)胞的脫氧葡萄糖攝取,這一過(guò)程需要EGFR參與,而通過(guò)單克隆抗體阻礙EGFR與其配體結(jié)合則抑制了EGF-β攝取葡萄糖的過(guò)程以及Hardin等通過(guò)TYR(一種酪氨酸激酶抑制劑)抑制兔空腸刷狀緣囊膜的GLUT表達(dá)推論,EGFR突變最終會(huì)使癌細(xì)胞的FDG攝取增高[19]。而日本學(xué)者Sasaki對(duì)283例非小細(xì)胞肺癌手術(shù)患者的病理標(biāo)本進(jìn)行EGFR及Kras基因突變檢測(cè),并對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLUT-1)進(jìn)行免疫組化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)GLUT-1在男性、吸煙者、非腺癌以及EGFR野生型、Kras突變型患者中表達(dá)更高。GLUT-1與FDG的攝取呈正相關(guān)關(guān)系[20]。以上基礎(chǔ)研究結(jié)論大相徑庭,因此,我們認(rèn)為腫瘤糖代謝與EGFR基因突變是兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素,二者是否存在關(guān)聯(lián)有待商榷。

從預(yù)后角度而言，實(shí)體性及微小乳頭狀的預(yù)后較差，乳頭狀及腺泡樣中等，而非粘液性伏壁樣生長(zhǎng)方式的腫瘤預(yù)后較好[21]。我們將微小浸潤(rùn)性腺癌、伏壁樣生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性腺癌歸為一組，在排除了大小對(duì)SUV的影響后發(fā)現(xiàn)腺癌不同病理亞型的SUV不同，其中貼壁生長(zhǎng)+微小浸潤(rùn)型組最低，實(shí)體生長(zhǎng)型代謝最高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chiu等對(duì)150例手術(shù)切除腺癌標(biāo)本進(jìn)行重新分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)實(shí)體性腺癌的FDG攝取明顯較其他類(lèi)型高，并且認(rèn)為SUV的增高與GLUT-1的表達(dá)明顯相關(guān)。而Nakamura等學(xué)者按照新的病理分型，將所有病灶分為低、中、高不同危險(xiǎn)度三組，各組間的SUVmax有明顯差異[22]。Qiang等學(xué)者按照新的病理分型，比較18F-FDG PET/CT與核磁彌散加權(quán)成像(DW MR)對(duì)腺癌的預(yù)后評(píng)價(jià)，認(rèn)為高SUV與低ADC都是預(yù)后不佳的因素[23]，SUV可能是一個(gè)獨(dú)立的術(shù)前危險(xiǎn)度分層的因素。

腺癌各亞型的葡萄糖攝取程度不同，其中實(shí)體為主型SUV最高,微小浸潤(rùn)與貼壁生長(zhǎng)為主型SUV最低，浸潤(rùn)性粘液腺癌SUV居前兩者之間，乳頭為主及腺泡為主型SUV相近，較前述后兩者高。腺癌各亞型原發(fā)灶的葡萄糖代謝程度與其EGFR19及21外顯子的基因型無(wú)關(guān), 不能通過(guò)18F-FDG代謝程度來(lái)預(yù)測(cè)EGFR是否存在這兩個(gè)外顯子的突變，二者是獨(dú)立的生物學(xué)指標(biāo),反映腫瘤不同的生物學(xué)信息。