何琪富，郭紫晶，李 然，周 軍，岳 華，2，張 斌，2，湯 承，2*

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.國家民委青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，成都 610041)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)可以引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道疾病，該病毒在世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BCoV屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬2a亞群，其基因組是RNA病毒中最大的，長度為27～32 kb ，主要包括2個(gè)開放閱讀框(ORF1a和ORF1b)和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：血凝素酯酶蛋白(HE)、纖毛蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)。編碼核衣殼蛋白的N基因高度保守，常作為BCoV的分子檢測(cè)的靶基因[2]。

RT-PCR方法是病原檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查的主要方法，目前國內(nèi)外已建立了多種檢測(cè)BCoV RT-PCR方法，靶基因多為N基因[2-9]，也有選擇編碼跨膜蛋白的M基因[10]。最近作者實(shí)驗(yàn)室采用國外BCoV診斷和流行病學(xué)調(diào)查常用的RT-PCR方法[2]，以及國內(nèi)常用的RT-PCR方法[3]復(fù)核宏病毒組技術(shù)證實(shí)為BCoV陽性的牛腹瀉糞便樣本時(shí)，結(jié)果兩種方法均未能檢出BCoV，其原因有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)的目的是建立靈敏度更高的BCoV RT-PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法對(duì)川西北草原牦牛腹瀉糞便樣本和患呼吸道疾病綜合征的牦牛鼻腔棉拭子進(jìn)行BCoV的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株、臨床樣本

BCoV陽性株，用于特異性驗(yàn)證的病毒(菌)株及核酸樣本：牛輪狀病毒(bovine rotavirus virus，BRV)、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)Swun0603、牛星狀病毒(bovine astrovirus，BAstV)Swun0201、牛腸炎病毒(bovine enterovirus，BEV)Swun0510、牛細(xì)小病毒(bovine parvovirus，BPV)、牛kobu病毒(bovine Kobu virus，BKV)、牛源K99大腸桿菌Swun4025、牛源都柏林沙門菌Swun3736、牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌Swun2930、牛源空腸彎曲桿菌Swun1639、牛源艾美爾球蟲、牛源安氏隱孢子蟲的核酸樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存。

用于檢測(cè)方法比較的樣本：56份3～6月齡肉牛腹瀉糞便樣本(2017年采自四川省4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng))、57份3～6月齡肉牛有明顯呼吸道疾病癥狀的鼻拭子(2017年采自四川省4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng))、20份3月齡以內(nèi)牦牛腹瀉糞便樣本(2015年采自四川省紅原縣)、20份3月齡以內(nèi)牦牛有明顯呼吸道疾病癥狀的鼻拭子(2015年采自四川省紅原縣)。

用于流行病學(xué)調(diào)查的樣本：125份3月齡以內(nèi)牦牛腹瀉糞便樣本(2016年6～8月采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的8個(gè)牧場(chǎng))、98份6月齡以內(nèi)有咳嗽、流鼻涕等明顯呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子樣本(2016年7～10月 采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的7個(gè)牧場(chǎng))。所有樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTMReagent、PrimeScriptTM、PMD19-T克隆載體等購于TaKaRa公司；DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購于寶生物工程(大連)股份有限公司；AXY prepTMDNA膠回收試劑盒購于Axygen公司；紫外分光光度計(jì)Cary50Probe(Vatian公司，美國)；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)。

1.3 檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)與合成

在對(duì)GenBank收錄的全部19條BCoV全基因組序列及本實(shí)驗(yàn)室宏病毒組數(shù)據(jù)(GenBank accession number：srp 108885)生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選擇比N基因更為保守的聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，引物序列：F:5′-CGAGTTGAACACCCAGAT-3′ R:5′-GAGACGG-GCATCTACACT-3′，見表1，擴(kuò)增長度為230 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 核酸提取

將臨床糞便樣本及呼吸道樣本與PBS(1∶5)充分重懸混勻，-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，再以12 000 r·min-1離心30 min，取上清，然后按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?；DNA提取采用酚-氯仿法，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 陽性質(zhì)粒的制備

以BCoV陽性cDNA為模板，加入本試驗(yàn)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送生工生物有限公司測(cè)序。

1.6 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

采用25 μL體系(預(yù)混酶12.5 μL，BCoV陽性標(biāo)準(zhǔn)品1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL)，對(duì)退火溫度從45～55 ℃進(jìn)行優(yōu)化，再以優(yōu)化的退火溫度對(duì)濃度為10 μmol·μL-1的引物用量(0.5～1.5 μL)進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 特異性評(píng)價(jià)

用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-PCR方法對(duì)“1.1”中待檢病原的核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本和陰性對(duì)照，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性評(píng)價(jià)

用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法對(duì)3個(gè)陽性模板及3份陰性樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，以評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。

1.9 敏感性測(cè)定

將牛CoV陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，對(duì)本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)下限。

1.10 三種RT-PCR方法的比較

1.10.1 三種方法對(duì)臨床樣本中BCoV檢出率的比較 采用所建立的RT-PCR方法和文獻(xiàn)[2]、[3]報(bào)道的檢測(cè)BCoV的RT-PCR方法同時(shí)對(duì)56份肉牛、20份牦牛腹瀉糞便樣本、57份肉牛及20份牦牛呼吸道鼻腔拭子進(jìn)行檢測(cè)，比較這3種方法的檢出率，引物信息見表1，三種方法檢測(cè)為陽性的PCR產(chǎn)物全部送公司測(cè)序。

表1RT-PCR方法的引物信息表

Table1PrimersinformationforthreekindsofRT-PCRassay

檢測(cè)方法Test method靶基因Target gene引物序列Primer sequence引物來源Source of primers1聚合酶基因F:5'-CGAGTTGAACACCCAGAT-3'本研究R:5'-GAGACGGGCATCTACACT-3'2NF:5'-GCAATCCAGTAGTAGAGCGT-3'[2]R:5'-CTTAGTGGCATCCTTGCCAA-3'3NF:5'-GAGCGTCCTTTGGAAATCGT-3'[3]R:5'-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3'

1.10.2 三種方法的靈敏度比較 利用文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[3]中檢測(cè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送生工生物有限公司測(cè)序。將陽性質(zhì)粒10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，比較三種RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)下限。

1.11 臨床樣本中BCoV的檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法對(duì)2016年采自川西北草原的125份牦牛腹瀉糞便樣本以及98份 有咳嗽、流鼻涕等明顯呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子樣本進(jìn)行BCoV的檢測(cè)，分析牦牛CoV在川西北草原的流行情況。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系及條件

優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系及條件：預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；49 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃ 反應(yīng)結(jié)束。

2.2 方法的特異性

該方法能從BCoV陽性樣本中檢出目的基因片段，對(duì)BRV、BVDV、BAstV、BEV、牛細(xì)小病毒、牛Kobu病毒、牛源K99大腸桿菌、牛源都柏林沙門菌、牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌、牛源艾美爾球蟲、牛源安氏隱孢子蟲的核酸樣本無擴(kuò)增。

2.3 方法的重復(fù)性

用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物對(duì)同一模板3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致，證明該方法有良好的重復(fù)性(結(jié)果未展示)。

2.4 方法的敏感性

對(duì)“1.5”中所制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)量濃度為100 ng·μL-1，敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，在1×107稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品仍可見目的條帶，對(duì)BCoV的核酸最低檢測(cè)限為1×10-2pg· μL-1,說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法具有較好的靈敏性。

2.5 三種檢測(cè)BCoV方法的比較

2.5.1 三種檢測(cè)BCoV方法對(duì)臨床樣本的檢出率 三 種方法對(duì)臨床樣本中BCoV的檢出率見表2，檢出的全部陽性PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證實(shí)均為BCoV基因片段。方法2和方法3檢出BCoV陽性的數(shù)量和編號(hào)一致，且本試驗(yàn)建立的方法檢出的陽性樣本包含了方法2、3檢測(cè)的全部樣本。可見本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法對(duì)肉牛和牦牛的BCoV檢測(cè)都有良好的檢測(cè)效果。

表2三種方法檢出率比較

Table2ThedetectionrateofthreekindsofRT-PCRassay

檢測(cè)方法Test method肉牛樣本類型及結(jié)果Sample type and results of beef cattle牦牛樣本類型及結(jié)果Sample type and results of yak腹瀉糞便(n=56)呼吸道(n=57)腹瀉糞便(n=20)呼吸道(n=20)方法來源Source of primers112.50%(7/56)12.28%(7/57)75.00%(15/20)70.00%(14/20)本研究25.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[2]35.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[3]

2.5.2 三種檢測(cè)BCoV方法的靈敏度 利用核酸蛋白濃度分析儀測(cè)量三種陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度均為100 g·μL-1，敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的方法的靈敏度為1×10-2pg·μL-1，參考文獻(xiàn)[2]報(bào)道方法和參考文獻(xiàn)[3]報(bào)道方法的靈敏度分別為1×100、1×101pg·μL-1。本試驗(yàn)建立方法靈敏性比參考文獻(xiàn)[2]報(bào)道的方法的靈敏性高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，比參考文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法的靈敏性高了三個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.6 臨床樣本中BCoV的檢測(cè)

利用本試驗(yàn)建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)2016年6—8月份采自四川省阿壩藏羌自治州紅原縣、若爾蓋縣、阿壩縣的125份犢牦牛腹瀉糞便樣本以及98份有呼吸道疾病綜合征的牦牛鼻腔拭子進(jìn)行BCoV的檢測(cè)，結(jié)果如表3、表4所示。對(duì)檢出的陽性樣本隨機(jī)挑選20%進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)檢出無誤，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3牦牛腹瀉樣本中BCoV的檢出率

Table3ThedetectionrateofyakBCoVinfectionindiarrheasamples

牧場(chǎng) FarmsABCDEFGH合計(jì) Total樣本數(shù)/份 Samples181930101051320125陽性樣本數(shù)/份 Positive samples13132177491589陽性率/% Positive rates72.2268.4270.0070.0070.0080.0069.2375.0071.20

表4牦牛呼吸道樣本中BCoV的檢出率

Table4ThedetectionrateofyakBCoVinfectioninnasalcavitysamples

牧場(chǎng) FarmsABCDEFG合計(jì) Total樣本數(shù)/份 Samples1515101517141298陽性樣本數(shù)/份 Positive samples11107111310971陽性率/% Positive rates73.3366.6770.0073.3376.4771.4375.0072.45

3 討 論

犢牛腹瀉是臨床上最常見的一類疾病，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。犢牛腹瀉病因復(fù)雜，其中病原微生物感染是造成牛腹瀉的重要原因，引起犢牛腹瀉的常見病毒有BCoV、BRV、BVDV[11-12]。并且有新的致腹瀉病毒出現(xiàn)，如諾如病毒、Nebovirus等[13-14]，使診斷更加困難。本實(shí)驗(yàn)室前期用宏病毒組技術(shù)無偏差鑒定犢牛腹瀉樣本中病毒種類時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在BCoV核酸序列(GenBank accession number：srp 108885)，但采用國外BCoV診斷和流行病學(xué)調(diào)查常用的RT-PCR方法[2]以及國內(nèi)常用的RT-PCR方法[3]進(jìn)行復(fù)核時(shí)，兩種方法均未能檢出。由于BCoV是危害養(yǎng)牛業(yè)重要病原之一，因此有必要建立新的RT-PCR方法，以提高對(duì)臨床樣本中BCoV的檢出率。鑒于采用的兩個(gè)以N基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)的RT-PCR方法未能檢出宏病毒組技術(shù)證實(shí)為BCoV陽性的牛腹瀉糞便樣本。因此，我們對(duì)GenBank中全部19條BCoV的聚合酶基因以及47條N基 因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)N基因變異率為0.011，超過20%毒株在同一位點(diǎn)發(fā)生變異比例為0.014(20/1 470)；聚合酶基因Nsp7-Nsp9序列變異率為0.004，超過20%毒株在同一位點(diǎn)發(fā)生變異比例為0.003(10/3 193)，其變異率顯著低于N基因變異率。同時(shí)，聚合酶基因在人和動(dòng)物的CoV中也是常用的分子檢測(cè)靶點(diǎn)[15-16]。因此，根據(jù)BCoV聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段設(shè)計(jì)引物，成功建立方法，特異性和重復(fù)性好，靈敏性是目前BCoV RT-PCR檢測(cè)方法中最高的[2-3]，對(duì)肉牛和牦牛都有很好的檢測(cè)效果，為BCoV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力工具。

關(guān)于牦牛BCoV的流行病學(xué)資料很少，還沒有見到關(guān)于病原流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道。但從僅有的3篇 相關(guān)牦牛血清流行病學(xué)調(diào)查[17-19]數(shù)據(jù)表明，BCoV的血清陽性率很高。川西北草原屬青藏高原東南緣，是我國五大牧區(qū)之一，也是我國主要的牦牛養(yǎng)殖地區(qū)之一。由于青藏高原特殊的自然地理環(huán)境，牦牛產(chǎn)犢主要集中在4—5月份，犢牛腹瀉導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率都很高，造成嚴(yán)重?fù)p失[20]。作者對(duì)2016年6—8月采自該地區(qū)犢牛腹瀉糞便樣本調(diào)查表明，BCoV場(chǎng)陽性率8/8，樣本陽性率71.20%，表明川西北牦牛腹瀉樣本中BCoV檢出率很高。鑒于BCoV是犢牛腹瀉、成年牛冬痢的重要病原，可以確定BCoV是川西北牦牛腹瀉的重要原因，為犢牛腹瀉的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

牛呼吸道疾病綜合征是危害養(yǎng)牛業(yè)的另一大類疾病[21-22]，其中病毒感染是重要病因。常見的病毒有BPIV3、BVDV、IBRV、BCoV、BRSV等[23-27]。病毒感染后損害呼吸道黏膜的完整性引起發(fā)病，在細(xì)菌、支原體等混合/繼發(fā)感染時(shí)病情加重[28-29]。呼吸道疾病綜合征也是牦牛多發(fā)病，但目前未見關(guān)于牦牛呼吸道疾病綜合征的病原流行病學(xué)資料。對(duì)2016年 川西北草原牦牛98份呼吸道樣本進(jìn)行病原學(xué) 檢測(cè)，牦牛CoV 場(chǎng)陽性率是7/7，樣本陽性率72.45%。BCoV不僅可以引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢，而且是牛呼吸道疾病綜合征的重要病因[25,30]。因此，在川西北牦牛呼吸道疾病綜合征中BCoV扮演著重要角色。

4 結(jié) 論

成功建立BCoV的RT-PCR檢測(cè)方法，該方法特異性和重復(fù)性好，靈敏性達(dá)到1×10-2pg·μL-1，為BCoV 的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段；流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示川西北草原牦牛腹瀉糞便樣本和表現(xiàn)有呼吸道疾病癥狀牦牛的深部鼻腔拭子中BCoV陽性率很高，證明BCoV是川西北草原牦牛腹瀉和呼吸道疾病綜合征的重要病原。