硫酸小檗堿對豬輪狀病毒感染的IPEC-J2中TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1 mRNA表達(dá)的影響

徐環(huán)葉，李妹玲，陳立功,，王麗葉，孟利佳，崔 歡，張 誠，白 曉，王迎春，董世山,*

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071001； 2.農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)華北科學(xué)觀測實驗站，保定 071001； 3.邯鄲市涉縣農(nóng)牧局，邯鄲 056400)

仔豬腹瀉是各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中遇到的普遍難題，其中病毒性腹瀉在規(guī)?；i場的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]，豬輪狀病毒是引起仔豬腹瀉的病原之一，病毒主要侵害小腸，導(dǎo)致腸道黏膜損傷，使小腸吸收功能失調(diào)，從而引起腹瀉，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉等癥狀[2]。因此，如何采取有效措施保護和修復(fù)腸道損傷，防治仔豬的腹瀉，提高仔豬成活率，已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟待解決的問題。

小檗堿又名黃連素[3]，是從中藥黃連等植物中提取的異喹啉類生物堿，其硫酸鹽衍生物即硫酸小檗堿(berberine sulfate，BS)，在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床都具有確切的抗腹瀉功效，能明顯延長小腸傳遞時間，對治療消化道黏膜損傷和潰瘍效果較佳。

近年來，許多文獻(xiàn)報道小檗堿具有抗病原體、抗毒素、調(diào)節(jié)機體免疫功能等藥理作用[4-6]，關(guān)于其對腸道修復(fù)因子基因表達(dá)的影響尚未見相關(guān)報道。腹瀉期間腸道黏膜損傷后，腸道修復(fù)受多種修復(fù)因子調(diào)節(jié)。其中促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育和修復(fù)的生長因子主要有轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、表皮生長因子受體(EGFR)、表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF1)。這些因子不僅能夠調(diào)控腸上皮細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化，刺激腸道發(fā)育，并且能修復(fù)受損的腸道黏膜，是腹瀉治療的關(guān)鍵[7-9]。前期研究已經(jīng)利用MTT法篩選BS對體外培養(yǎng)的IPEC-J2最大安全濃度為20 μmol·L-1，本研究通過PoRV感染IPEC-J2建立試驗?zāi)Ｐ?，攻毒?預(yù)防組)和攻毒后(治療組)使用濃度為0、5、10 μmol·L-1的BS進(jìn)行干預(yù)，同時設(shè)空白對照組，對黏膜修復(fù)因子基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，以揭示BS防治腹瀉的作用機制是否與調(diào)控腸道修復(fù)因子的表達(dá)有關(guān)，對豐富中獸醫(yī)理論和開發(fā)防治仔豬腹瀉的中藥制劑意義重大。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞(IPEC-J2)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；Marc145細(xì)胞，由本試驗室保存；豬輪狀病毒(CVCCAV55)，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑

硫酸小檗堿，購自上海源葉生物制品有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、熒光定量試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司；pEASY-T1Cloning Kit和Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 IPEC-J2細(xì)胞分組與處理

治療組：將細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各攻毒200 μL，37 ℃感作1 h，棄掉病毒液，加維持液正常培養(yǎng)24 h后，棄掉維持液，分別加濃度為0、5、10 μmol·L-1的硫酸小檗堿2 mL，給藥后，繼續(xù)培養(yǎng)，在6、12、24、36、48 h時，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，拍照保存后收集細(xì)胞，備用。

預(yù)防組：首先在各孔細(xì)胞中加濃度為0、5、10 μmol·L-1硫酸小檗堿2 mL，分別在6、12、24、36、48 h時將藥液吸出，各攻毒200 μL感作1 h，加維持液培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，拍照保存后收集細(xì)胞，備用。

空白對照組：細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，不進(jìn)行攻毒和藥物處理，細(xì)胞維持液培養(yǎng)。每個樣品重復(fù)3次。

1.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.4.1 細(xì)胞總RNA的提取 選擇上述培養(yǎng)的空白對照組IPEC-J2細(xì)胞，采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總RNA，使用核酸蛋白測定儀測定總RNA的濃度和純度，并分裝出5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。RNA產(chǎn)物-80 ℃保存，備用。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA參照相關(guān)試劑盒的操作(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)，反應(yīng)體系20 μL。如下：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL， gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1.0 μL，用RNase Free dH2O補足10.0 μL。室溫反應(yīng)5 min。再添加PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL， RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real-Time) 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，混勻后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存，備用[10-11]。

1.4.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的豬TGF-β1(NM_214015.1)、EGFR(NM_214007.1)、EGF(NM_214020.1)、IGF1(NM_214256.1)、β-actin(XM_003124280.4)的基因序列為模板，采用Premier5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由上海生物工程公司合成。

表1目的基因引物序列和擴增片段長度

Table1Primersequenceandlength

基因Genes引物序列(5'→3')Sequence of primer擴增長度/bpLengthTGF-β1-FGTGGAAAGCGGCAACCAA119TGF-β1-RGCCCGAGAGAGCAATACAGGEGFR-FATCTGTAACCCGCTGTGCTC147EGFR-RGGCATTCTCCACGAACTCTCEGF-FTGGCAGATGCTGGAATATCA120EGF-RTCTCTTGCCTTGTCCCATTCIGF1-FATCACATCCTCTTCGCATCTCTT145IGF1-RTGAAATAAAAGCCCCTGTCTCCβ-actin-FAGAGCAAGAGAGGCATCCTG111β-actin-RCACGCAGCTCGTTGTAGAAG

1.4.4 目的基因的克隆與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 參照TaKaRa EsTaqPCR試劑盒對TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1和β-actin部分片段進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)總體積為50 μL， 2×EsTaqDNA Polymerase 25 μL，上下游引物各1 μL， cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水18 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的基因后，產(chǎn)物與pEASY-T1Cloning Kit載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑選陽性菌落，LB培養(yǎng)基(含氨芐抗性)振蕩培養(yǎng)12 h，提取重組質(zhì)粒[12-13]。將所獲重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，挑取陽性克隆送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將測序結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒DNA，使用核酸蛋白測定儀測定質(zhì)粒濃度，并換算成標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)，倍比稀釋成105、106、107、108、109copies·μL-1，以不同濃度的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，儀器收集熒光信號，以質(zhì)粒拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)將自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)；循環(huán)完成后加一產(chǎn)物熔解曲線，用來分析熒光定量PCR反應(yīng)的特異性，條件：95 ℃降至65 ℃，每5 s降溫0.5 ℃。每個樣品孔重復(fù)三次，同時每個基因設(shè)立3個無模板陰性對照。

1.5 不同組IPEC-J2中TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1 mRNA表達(dá)的測定

1.5.1 樣本細(xì)胞IPEC-J2總RNA的提取與cDNA的合成 將上述培養(yǎng)的治療組和預(yù)防組IPEC-J2，按照寶生物工程(大連)有限公司試劑盒進(jìn)行總RNA的提取與cDNA的合成。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測樣本 嚴(yán)格按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說明書，將上述合成的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增和檢測，測定TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1基因mRNA表達(dá)水平。最后，對待測樣品進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對IPEC-J2生長狀態(tài)的影響

顯微鏡下可見，空白組IPEC-J2單層貼壁生長，排列整齊，生長狀態(tài)良好，呈梭形、多角形或卵圓形(如圖1A)；PoRV作用24 h后，IPEC-J2出現(xiàn)聚集成團、變性、脫落壞死甚至崩解死亡的現(xiàn)象(如圖1B)；預(yù)防組(如圖1C)和治療組(如圖1D)在PoRV攻擊前后使用BS藥物干預(yù)，可見IPEC-J2雖然部分細(xì)胞出現(xiàn)成團現(xiàn)象，但仍處于單層生長和緊密排列狀態(tài)，細(xì)胞的生長狀態(tài)明顯好于攻毒不給藥組。

A.空白組IPEC-J2生長狀態(tài)(100×)；B. PoRV作用24 h后IPEC-J2生長狀態(tài)(100×)；C. 預(yù)防組IPEC-J2，其中用藥濃度為10 μmol·L-1，作用時間12 h (100×)；D. 治療組IPEC-J2，其中用藥濃度為10 μmol·L-1，作用時間12 h (100×)A.The growth state of IPEC-J2 in the blank group (100×); B. The growth state of IPEC-J2 treated by PoRV after 24 hours (100×); C. The growth state of IPEC-J2 in the prevention group, in which the concentration of the drug was 10 μmol·L-1 and the time was 12 h (100×); D. The growth state of IPEC-J2 in the treatment group, in which the concentration of the drug was 10 μmol·L-1 and the time was 12 h (100×)圖1 不同處理對IPEC-J2生長狀態(tài)的影響Fig.1 The effection of different treatments on growth state of IPEC-J2

2.2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

2.2.1 總RNA提取情況 通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，提取的總RNA完整性良好。檢測樣品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0之間，RNA純度較高，適合后續(xù)試驗。

2.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 把提取的質(zhì)粒DNA做為模板，采用PCR進(jìn)行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒上的目的基因，結(jié)果為陽性，結(jié)果見圖2；將陽性菌液序列測定結(jié)果與GenBank中登錄的各目的基因序列進(jìn)行比較，相似性均為100%，說明擴增片段為各目的基因的特異片段，可進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.3 基因擴增動力學(xué)曲線 構(gòu)建各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，重復(fù)性較好。各基因的擴增效率均在95%～105%，線性回歸系數(shù)均大于0.99，表明在一定范圍內(nèi)，起始模板與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，反映了目的產(chǎn)物的擴增效率較好。熔解曲線峰值單一，表明在擴增過程中，無引物二聚體和其他非特異性產(chǎn)物擴增，引物具有很好的特異性，說明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

M. DL1000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. IGF1基因PCR產(chǎn)物; 2. EGFR基因PCR產(chǎn)物; 3. EGF基因PCR產(chǎn)物; 4. TGF-β1 基因PCR產(chǎn)物; 5. β-actin基因PCR產(chǎn)物M. DL1000 DNA marker;1. PCR product of IGF1 gene; 2. PCR product of EGFR gene; 3. PCR product of EGF gene; 4. PCR product of TGF-β1 gene; 5. PCR product of β-actin gene圖2 目的基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR product of target gene

2.3 不同處理組細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄量

從表2可見，BS對TGF-β1mRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用，5 μmol·L-1的BS無論攻毒前后用藥，TGF-β1mRNA表達(dá)比對照組顯著升高(P<0.05)；10 μmol·L-1的BS能夠極顯著升高TGF-β1mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預(yù)防用藥組BS pre-treatment groups01.01±0.03 1.02±0.11 1.10±0.01 1.12±0.06 1.04±0.12 51.67±0.18*1.71±0.10*2.27±0.11*1.59±0.01*1.62±0.02*103.53±0.61**3.50±0.44**4.47±0.14**3.40±0.20**3.59±0.04**攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.97±0.03 1.05±0.12 1.08±0.04 1.04±0.12 1.04±0.0251.46±0.14*1.56±0.19*2.38±0.07*1.48±0.06*1.60±0.03*103.19±0.17**3.21±0.06**3.16±0.14**2.99±0.07**3.08±0.14**

與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

Compared with control group，* means difference between the treatments (P<0.05)，** means significant difference between the treatments (P<0.01). The same as below

由表3可知，BS對EGFRmRNA表達(dá)具有促進(jìn)作用，6和12 h時，預(yù)防用藥組和治療用藥組較各對照組EGFRmRNA的表達(dá)有不同程度的升高，差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。其中預(yù)防用藥時間12 h，濃度為5、10 μmol·L-1，以及治療用藥6 h，濃度為10 μmol·L-1時，EGFRmRNA的表達(dá)較各對照組極顯著升高(P<0.01)；用藥時間6 h，預(yù)防用藥濃度為10 μmol·L-1和治療用藥濃度為5 μmol·L-1，以及用藥時間12 h，治療用藥濃度為10 μmol·L-1時，EGFRmRNA的表達(dá)較各對照組顯著升高(P<0.05)。藥物處理24、36和48 h組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預(yù)防用藥組BS pre-treatment groups00.84±0.21 1.03±0.36 0.82±0.29 0.75±0.25 1.09±0.11 51.03±0.13 3.11±0.26**0.84±0.30 0.87±0.27 1.13±0.23 101.46±0.07* 4.21±0.19**1.20±0.29 0.68±0.19 1.03±0.16 攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.93±0.28 0.96±0.09 0.75±0.27 1.28±0.34 0.72±0.26 51.57±0.21* 1.11±0.13 0.90±0.20 1.34±0.23 0.73±0.11 102.07±0.21**2.05±0.10* 0.70±0.30 1.24±0.10 0.66±0.22

由表4可知，BS對EGFmRNA表達(dá)具有抑制作用，6、12和24 h時，預(yù)防用藥組和治療用藥組較各對照組EGFmRNA的表達(dá)不同程度的降低，差異顯著(P<0.05)或差異極顯著(P<0.01)。其中預(yù)防用藥時間12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1時，EGFmRNA的表達(dá)較對照組極顯著減少(P<0.01)；其中預(yù)防用藥時間6 h，用藥濃度為10 μmol·L-1，治療用藥時間12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1，以及治療用藥時間24 h，用藥濃度為10 μmol·L-1時，EGFmRNA的表達(dá)較各對照組顯著(P<0.05) 減少。其他藥物處理組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預(yù)防用藥組BS pre-treatment groups攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.82±0.200.68±0.280.99±0.290.66±0.270.12±0.1550.48±0.190.03±0.001**1.24±0.230.65±0.150.24±0.12100.26±0.04*0.02±0.003**1.03±0.180.83±0.170.31±0.1801.03±0.261.14±0.210.73±0.241.16±0.161.13±0.1650.87±0.180.72±0.11*0.85±0.131.01±0.281.03±0.17100.84±0.170.50±0.09*0.29±0.09*1.07±0.270.89±0.12

由表5可知，BS對IGF1mRNA表達(dá)具有抑制作用，預(yù)防用藥12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1時，IGF1mRNA的表達(dá)較對照組極顯著降低(P<0.01)；預(yù)防用藥時間6 h和治療用藥時間24 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1，以及治療用藥時間36 h， 濃度為10 μmol·L-1，IGF1mRNA的表達(dá)較對照組顯著(P<0.05) 降低。其他藥物處理組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預(yù)防用藥組BS pre-treatment groups攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.87±0.130.63±0.260.72±0.130.79±0.210.63±0.1450.47±0.16*0.02±0.003**1.24±0.250.75±0.090.55±0.02100.31±0.17*0.01±0.004**1.09±0.190.63±0.180.57±0.0500.30±0.101.07±0.140.59±0.090.62±0.130.73±0.2850.25±0.141.03±0.180.43±0.16*0.50±0.080.35±0.26100.32±0.211.09±0.120.10±0.03*0.16±0.06*0.45±0.11

3 討 論

腹瀉是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病。豬輪狀病毒感染引起腹瀉是由于小腸黏膜的損傷，新生的上皮細(xì)胞功能低下，腸吸收不良，造成腸腔滲透壓升高，從而導(dǎo)致腹瀉[14-16]。腸道黏膜損傷后的黏膜修復(fù)對腹瀉仔豬的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。本試驗選定與腸黏膜損傷后修復(fù)密切相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β1、EGFR、EGF和IGF1作為研究對象，以揭示硫酸小檗堿防治腹瀉的作用機制是否與調(diào)控腸道修復(fù)因子的表達(dá)有關(guān)，對仔豬腹瀉的病理生理機制研究及其防治意義重大。

TGF-β1是一類具有多種功能的生長因子，在細(xì)胞生長、分化、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等過程的調(diào)控中發(fā)揮極為重要的作用[17]。張志楊[18]發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者TGF-β1表達(dá)有顯著增強趨勢，且和UC患者嚴(yán)重程度相關(guān)。林源等[19]發(fā)現(xiàn)，胃潰瘍(肝郁脾虛證)患者經(jīng)健胃愈瘍顆粒劑治療后，TGF-β1及其mRNA表達(dá)增強，說明健胃愈瘍顆粒劑能通過促進(jìn)胃黏膜TGF-β1等促潰瘍愈合因子的表達(dá)來加速潰瘍的愈合。本試驗結(jié)果顯示硫酸小檗堿攻毒前或后給藥都能明顯改善IPEC-J2生長狀態(tài)，對IPEC-J2具有良好保護作用。同時BS劑量依賴性增強TGF-β1的表達(dá)，表明BS可能通過調(diào)節(jié)腸黏膜細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)達(dá)到保護和促進(jìn)黏膜修復(fù)，進(jìn)而實現(xiàn)對腹瀉的防治作用。

EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶家族，是TGF和EGF的通用受體[20]，EGFR在正常機體胃腸黏膜的上皮細(xì)胞分泌較少，損傷時可見EGFR分布區(qū)的表達(dá)明顯增加[21]。對胃黏膜的保護及其損傷的修復(fù)有重要作用[22]。本試驗結(jié)果顯示損傷的IPEC-J2經(jīng)硫酸小檗堿處理后，EGFRmRNA表達(dá)顯著增強，同時配體TGF-β1表達(dá)顯著增強，共同促進(jìn)IPEC-J2生長和黏膜修復(fù)。說明硫酸小檗堿可能通過調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞EGFR的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)損傷愈合。

EGF是一個很強的促細(xì)胞分裂因子，能增強胃黏膜細(xì)胞抵抗胃酸的侵蝕能力，在保護胃黏膜免受損傷因子破壞[23]，維持胃黏膜完整性方面起著非常重要的作用。顧玲[24]發(fā)現(xiàn)膽胃寧顆粒通過提高EGF的含量，促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，增強胃黏膜防御功能，從而促進(jìn)胃潰瘍的愈合。本試驗發(fā)現(xiàn)損傷IPEC-J2經(jīng)硫酸小檗堿處理后，EGFmRNA表達(dá)與對照組相比顯著降低，由于TGF與EGFR結(jié)合競爭力更強，TGF-β1顯著表達(dá)可能導(dǎo)致EGF表達(dá)抑制，也可能由于EGF與EGFR表達(dá)具有反向調(diào)控作用[25]。BS促進(jìn)EGFR表達(dá)同時反向抑制了EGF的表達(dá)，實現(xiàn)EGFR與TGF-β1協(xié)同表達(dá)增強對腸黏膜上皮細(xì)胞保護和促進(jìn)修復(fù)作用。

IGF1是含有70個氨基酸的堿性多肽，是一類廣譜性的促生長因子。研究表明IGF1與胚胎分化、個體發(fā)育密切相關(guān)，參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，可刺激細(xì)胞代謝，與其他生長因子協(xié)同，刺激腸道細(xì)胞的增殖[26-27]。一些研究表明，通過口服可以刺激新生動物胃腸道組織的生長和功能的成熟[28]。仔豬可通過添加外源生長因子加強腸道的生長和發(fā)育[29]。本試驗觀察到IPEC-J2損傷后利用BS治療過程中出現(xiàn)IGF1mRNA的表達(dá)顯著降低，說明硫酸小檗堿對IGF1表達(dá)具有抑制作用，具體機制還需要進(jìn)一步研究。

本研究采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的檢測方法，通過構(gòu)建目的基因TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1與內(nèi)參基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線對各基因擴增效率進(jìn)行檢測[30]。結(jié)果表明：在不同的稀釋條件下，各目的基因稀釋倍數(shù)的對數(shù)值與其Ct值之間呈線性關(guān)系，經(jīng)過PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[31]，本試驗各基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均在-3.6～-3.0，此時得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性較高；各基因的擴增效率均在95%～105%，說明引物設(shè)計合理，線性關(guān)系好，標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋恰當(dāng)；當(dāng)樣本稀釋到105時，仍能夠檢測到擴增產(chǎn)物，提示該方法有良好的靈敏度。各目的基因和內(nèi)參基因相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明在一定范圍內(nèi)，起始模板與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系，反映目的產(chǎn)物的擴增效率較好。熔解曲線峰值單一，表明在擴增過程中，無引物二聚體和其他非特異性產(chǎn)物擴增，引物具有很好的特異性，說明結(jié)果準(zhǔn)確可靠[32]，為后續(xù)試驗奠定良好基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過PoRV感染IPEC-J2建立試驗?zāi)Ｐ停止ザ厩昂笫褂肂S進(jìn)行干預(yù)，對黏膜修復(fù)因子基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。PoRV能夠顯著引起IPEC-J2變性和壞死脫落，用BS藥物組的IPEC-J2則生長基本良好。BS有促進(jìn)病毒損傷IPEC-J2中TGF-β1和EGFRmRNA表達(dá)，抑制EGF和IGF1mRNA表達(dá)的作用。預(yù)防組和治療組比較，預(yù)防組在時間上表現(xiàn)更提前。在腸黏膜細(xì)胞損傷修復(fù)過程中，各細(xì)胞因子發(fā)揮的作用以及作用時間存在差異。提示，中藥提取物BS可能通過調(diào)節(jié)損傷的腸黏膜上皮細(xì)胞修復(fù)因子的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和發(fā)育，對損傷的腸道黏膜起到保護和修復(fù)功能。