10種豬常見病毒基因芯片檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

羅 寧，王 群，張小龍，房保海，姜 帆，石玲玲，王冬冬，3，楊宗統(tǒng)，王守春，徐 彪*，尹燕博*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，青島 266109； 2. 山東出入境檢疫檢驗(yàn)局/食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，青島 266001； 3. 青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，青島 266225； 4. 澳蘭百特生物工程有限公司，青島 266101)

實(shí)驗(yàn)用豬在人類疾病發(fā)病機(jī)制研究、新藥研發(fā)等方面的應(yīng)用越來越廣泛，這些領(lǐng)域?qū)?shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量的要求也愈來愈高。病毒病是影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要因素之一，建立針對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬病毒病的快速、高通量檢測(cè)方法十分必要[1]。實(shí)驗(yàn)用豬病中，CSFV(classical swine fever virus)，PRRSV(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)，TGEV(transmissible gastroenteritis virus of swine)，PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)，SIV(swine influenza virus)，PRV(pseudorabies virus)，PCV2(porcine circovirus 2)，PPV(porcine parvovirus)，PCMV(porcine cytomegalovirus)，F(xiàn)MDV(food-and-mouth disease virus)是危害豬群健康的主要病原，且在臨床中存在多種病毒混合感染的情況[2]，因此同步、快速、高通量檢測(cè)這10種病毒病對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，針對(duì)病毒性傳染病的診斷一般采用病原分離鑒定以及血清學(xué)方法，但這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性較差，特別是當(dāng)豬群混合感染多種病原時(shí)，應(yīng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行早期快速檢測(cè)和鑒別診斷。基因芯片技術(shù)作為一種新興的分子生物學(xué)研究方法，具有高通量、多樣性、微量化以及自動(dòng)化的特點(diǎn)[3-5]。該方法快速、準(zhǔn)確，在疾病的診斷和病原體的篩查上發(fā)揮著越來越重要的作用[6]。

本研究針對(duì)豬常見的10種病毒設(shè)計(jì)了10對(duì)特異性引物，設(shè)計(jì)檢測(cè)基因點(diǎn)陣，探索研究同時(shí)檢測(cè)10種病毒的基因芯片檢測(cè)方法，并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用效果評(píng)價(jià)，以期進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室診斷效率，為實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制及這10種病毒的防控和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣本 2016年11月—2017年3月來源于遼寧葫蘆島、河南洛陽、山東膠州、廣西玉林采集的和送檢的臨床病料，來源于山東即墨屠宰線采集的樣本，均為肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等臟器組織，每個(gè)組織標(biāo)記為一個(gè)樣本，共1 006份樣本。

1.1.2 病毒毒株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA 1株購(gòu)自中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心；豬瘟弱毒疫苗、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)弱毒疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；豬偽狂犬病活疫苗、豬乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株購(gòu)自中牧股份實(shí)業(yè)有限公司；豬口蹄疫滅活病毒(A型、O型、Asia型)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。細(xì)小病毒滅活疫苗購(gòu)自吉林正業(yè)生物制品股份有限公司；豬流感病毒[7]由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；豬巨細(xì)胞病毒陽性病料[8]由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 晶芯光學(xué)級(jí)氨基基片、晶芯基因芯片點(diǎn)樣液均購(gòu)自北京博奧生物有限公司；核酸雜交液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；λ DNA、RNAiso Plus試劑、Reverse Transcriptase XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor(RNasin)RNA抑制劑、pMD19-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于AXYGEN公司；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒、2×EasyTaqPCR Super Mix、Trans2K DNA Marker購(gòu)自北京全式金公司；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV的H1N1、H3N2、H9N2亞型、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV的保守基因核苷酸序列，參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)10對(duì)特異性引物。其中TGEV的引物序列參考《豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法》[9]設(shè)計(jì)；FMDV引物根據(jù)Fernández等[10]設(shè)計(jì)；PPV根據(jù)《豬細(xì)小病毒病聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程》[11]設(shè)計(jì)。通過NCBI上的BLAST工具對(duì)這10對(duì) 引物進(jìn)行比對(duì)分析，分析表明這10對(duì)引物與其他病毒不存在任何同源性。每對(duì)引物合成一條上游引物和兩條下游引物，并將其中一條下游引物的5′端進(jìn)行Cy3分子修飾以對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)記。定位基因引物參考曹三杰等[12]設(shè)計(jì)合成。引物序列、目的基因以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1引物信息及目的基因片段長(zhǎng)度

Table1Informationofprimersforprobeandlengthoffragment

病毒Virus目的基因Target gene引物序列(5'→3')Sequences of primers長(zhǎng)度/bpExpected sizeCSFV5' UTRF:ACGTGAGCAGAAGCCCACCT247R:CCGGTTCCTCCACTCCCATTL:Cy3-CCGGTTCCTCCACTCCCATTPRRSVORF6F:GGCTTTCATCCGATTGCG270R:TTGCCTCTGGACTGGTTTL:Cy3-TTGCCTCTGGACTGGTTTTGEVNF:GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC276R:CAACCCAGACAACTCCATCTAL:Cy3-CAACCCAGACAACTCCATCTAPEDVNF:TCGGAACAGGACCTCACG447R:TTGACAGCAGCCACCAGAL:Cy3-TTGACAGCAGCCACCAGASIVMF:TTCTAACCGAGGTCGAAAC229R:AAGCGTCTACGCTGCAGTCCL:Cy3-AAGCGTCTACGCTGCAGTCCPRVgHF:ACCGTCTGAGAGAGACTGAACTTCTC355R:CCCTGATCTTAAATGACGAGGACGTGACL:CCAGTCCCCTTCTCAGATCPCV2ORF2F:TGACCTGTCTACTGCTGTGA472R:CCGTGGATAGTTCTGTAGCAL:Cy3-CCGTGGATAGTTCTGTAGCAPPVVP2F:GGGGAGGGCTTGGTTAGAAT322R:TGGTTGGTGGTGAGGTTGCTL:Cy3-TGGTTGGTGGTGAGGTTGCTPCMVgBF:CAGCGACACCGGAAGTTTCTACG263R:CGACAATTCCTTGGTATACGTCCL:Cy3-CGACAATTCCTTGGTATACGTCCFMDV3DF:GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC275R:CAWCGCAGGTAAAGTGATCTGL:Cy3-CAWCGCAGGTAAAGTGATCTGPositive geneλF:AAAGCGACGCAATGAGGCACT500R:GTTCCACGACCGCAACTGCL:Cy3-GTTCCACGACCGCAACTGC

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的制備

1.2.1.1 特異性目的基因的PCR擴(kuò)增：PRV、PCV2、PPV核酸提取采用酚-氯仿快速抽提法，CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、FMDV核酸提取采用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit進(jìn)行，RNA提取后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以提取的核酸DNA或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，以表1未標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10種病毒的PCR反應(yīng)體系為30 μL：DNA/cDNA 4 μL，上游引物(25 μmol·L-1)1.5 μL，下游引物(25 μmol·L-1)1.5 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix 15 μL，補(bǔ)ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，51～59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.1.2 PCR退火溫度的確定：以梯度PCR儀在51～59 ℃范圍內(nèi)自動(dòng)設(shè)置8個(gè)退火溫度梯度。梯度退火溫度51、51.3、52.2、53.4、54.8、56.3、57.7、59.2 ℃，每種病毒分別進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，以確定10種病毒的退火溫度。

1.2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。切膠后用DNA回收。將目的片段導(dǎo)入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)鑒定后保菌，提取克隆質(zhì)粒備用，將提取的質(zhì)粒送至生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.2 基因芯片的制備

1.2.2.1 靶基因及定位對(duì)照基因的制備：將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品10種病毒重組質(zhì)粒稀釋50倍后分別作為各PCR反應(yīng)模板，以表1不帶標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，定位對(duì)照基因以λDNA為模板用帶標(biāo)記和不帶標(biāo)記的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，作為芯片反應(yīng)的陽性質(zhì)控，反應(yīng)體系為100 μL：質(zhì)粒2 μL，上游引物(25 μmol·L-1)2 μL，下游引物(25 μmol·L-1)2 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix 50 μL，補(bǔ)ddH2O至100 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共40循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。鑒定后用酚-氯仿-異戊醇抽提法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.2.2 芯片的設(shè)計(jì)與制備：將靶基因和定位對(duì)照基因定量至400 ng·μL-1，加入等量的基因芯片點(diǎn)樣緩沖液配制成點(diǎn)樣液，將點(diǎn)樣液按芯片設(shè)計(jì)要求(圖1)加入96孔板內(nèi)，設(shè)純點(diǎn)樣緩沖液為陰性對(duì)照，用基因芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)在氨基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣。

圖1 基因芯片矩陣設(shè)計(jì)Fig.1 The design of DNA microarray spotting

點(diǎn)制好的芯片靜置于點(diǎn)樣儀上過夜固定，放入盛有0.2% SDS的燒杯中，室溫?fù)u床中清洗10 min，再放入盛有無水乙醇的燒杯中洗滌，上下快速提拉芯片架30次，重復(fù)此操作，放入50 mL離心管中，2 000 r·min-1室溫離心10 min甩干后密封，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因芯片雜交 試驗(yàn)采用Cy3直接標(biāo)記法標(biāo)記探針，以稀釋50倍的各標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒為模板，采用各病毒5′端標(biāo)記Cy3分子的下游引物和上游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將cDNA進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增結(jié)束后電泳鑒定進(jìn)行純化。雜交前為了保證同一張芯片上4個(gè)點(diǎn)陣區(qū)域有相同的反應(yīng)條件，并且為防止各個(gè)樣品之間產(chǎn)生交叉污染，需要對(duì)芯片進(jìn)行圍欄的粘貼，將膠粘貼至芯片上使平等分為四個(gè)區(qū)域。然后將芯片置于芯片架上，浸入98 ℃水中變性2 min，取出芯片架迅速浸入冰冷的乙醇中1 min，1 500 r·min-1室溫離心10 min甩干。與此同時(shí)進(jìn)行探針的變性處理，將純化后的各PCR產(chǎn)物混合，95 ℃水中變性5 min，立即冰浴2 min，后與雜交液按1∶2比例混合均勻。

使用Advalytix的生物芯片雜交儀SB401-0145進(jìn)行雜交， 55 ℃ 2 h。

1.2.4 芯片雜交后洗滌 雜交結(jié)束后，將芯片水平取出，放入預(yù)熱至42 ℃的洗滌液Ⅰ(0.3×SSC/0.1%SDS)中200 r·min-1室溫清洗2 min，取出芯片放入預(yù)熱至42 ℃的洗液Ⅱ(0.6% SSC)中200 r·min-1室溫清洗2 min，洗滌兩次，最后將芯片在無水乙醇中上下浸提幾次，然后把芯片放入離心管中，1 500 r·min-1離心10 min甩干。

1.2.5 芯片掃描與結(jié)果判定 芯片用晶芯LuxScan 10K進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)為綠色10 μm分辨率、532 nm單色熒光、100% Power Gain，掃描結(jié)果用16位tiff格式圖片保存，最后對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

當(dāng)?shù)?列與第14列陽性位點(diǎn)有綠色熒光信號(hào)，且2列和13列陰性位點(diǎn)沒有熒光信號(hào)時(shí)，芯片檢測(cè)結(jié)果為有效結(jié)果。結(jié)果軟件系統(tǒng)分析各位點(diǎn)的信噪比值(signal to noise ratio, SNR)，統(tǒng)計(jì)計(jì)算定位對(duì)照基因(10個(gè)位點(diǎn))和探針(各10個(gè)位點(diǎn))的平均SNR，根據(jù)10個(gè)點(diǎn)信號(hào)中位值(Median)以及其與背景信號(hào)平均值的比值(SNRm)為判定依據(jù)。當(dāng)Median≥1 000、SNRm值≥2；掃描出的各個(gè)點(diǎn)陽性清晰可見，三者結(jié)果一致可以判定為雜交結(jié)果成立。

1.2.6 芯片檢測(cè)的特異性、敏感性、重復(fù)性檢測(cè) 分別以正常組織、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、PRV、PCV2、PPV、JEV和PoRV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別與制備病毒基因芯片進(jìn)行雜交，以驗(yàn)證病毒基因芯片的特異性。

測(cè)定各病毒重組質(zhì)粒常規(guī)PCR膠回收產(chǎn)物的濃度，將各病毒回收產(chǎn)物等比例混合作101～108倍比稀釋后，分別與制備的基因芯片進(jìn)行雜交，以評(píng)價(jià)病毒基因芯片檢測(cè)的靈敏性。

以各病毒核酸為模板用帶Cy3分子標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備混合探針然后與3個(gè)批次的6張芯片(2張·批次-1)和同一批次的6張芯片進(jìn)行雜交，以檢驗(yàn)批次內(nèi)及批次間芯片之間的一致性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 隨機(jī)選取80份臨床樣品處理后取上清液用于病毒RNA或DNA的提取，然后反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用Cy3分子標(biāo)記的引物標(biāo)記探針，PCR擴(kuò)增后取5 μL電泳，其余與制備的基因芯片雜交，記錄電泳結(jié)果，與基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié) 果

2.1 PCR退火溫度的確定

10種病毒的PCR/RT-PCR最佳退火溫度范圍均較廣，PRRSV退火溫度在51～53.4 ℃之間會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，在53.4～59.2 ℃特異性擴(kuò)增效果良好，PRV退火溫度在52.2～56.3 ℃擴(kuò)增良好，F(xiàn)MDV退火溫度在51～54.8 ℃擴(kuò)增良好，其他病毒在51～59 ℃擴(kuò)增效果均良好無明顯差別(圖2)，10種病毒各自最佳退火溫度見表2。

表210種病毒最佳退火溫度

Table2Optimumannealingtemperatureoftenviruses

病毒VirusCSFVPRRSVTGEVPEDVSIVPRVPCV2PPVPCMVFMDV長(zhǎng)度/bpExpected size247270276447229355472322263275最佳退火溫度/℃Optimal annealing temperature51～59.253.4～59.251～56.351～59.251～59.252.2～56.351～56.351～59.251～59.251～54.8

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A. PRRSV；B. PCV2；C. PCMV；D. SIV；E. PRV；F. CSFV；G. PPV；H. PEDV；I. FMDV；J. TGEV；1. 51 ℃；2. 51.3 ℃；3. 52.2 ℃；4. 53.4 ℃；5. 54.8 ℃；6. 56.3 ℃；7. 57.7 ℃；8. 59.2 ℃M. DL2000 DNA marker;A. PRRSV; B. PCV2; C. PCMV; D. SIV; E. PRV; F. CSFV; G. PPV; H. PEDV; I. FMDV; J. TGEV; 1. 51 ℃; 2. 51.3 ℃; 3. 52.2 ℃; 4. 53.4 ℃; 5. 54.8 ℃; 6. 56.3 ℃; 7. 57.7 ℃; 8. 59.2 ℃圖2 單項(xiàng)PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization for annealing temperature of single PCR

2.2 10種標(biāo)準(zhǔn)品病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果及產(chǎn)物鑒定

以提取的CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV、λDNA的核酸為模板，用表1不代標(biāo)記的特異性引物分別擴(kuò)增相應(yīng)病毒。結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增出條帶與預(yù)期相符，分別約247、270、276、447、229、355、472、322、263、275 bp(圖3)。連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線工具BLAST比對(duì)分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增序列與10種病毒各自引物設(shè)計(jì)株的預(yù)期擴(kuò)增序列相似性均在99%以上，所測(cè)的序列分別為CSFV 5′ UTR基因、PRRSV ORF6基因、TGEVN基因、PEDVN基因、SIVM基因、PRVgH基因、PCV2 ORF2基因、PPVVP2基因、PCMVgB基因、FMDV 3D基因，均為各病毒高度保守基因序列區(qū)域，驗(yàn)證了基因芯片上的雜交結(jié)果的可信性。

2.3 芯片特異性檢測(cè)

使用帶標(biāo)記的引物分別擴(kuò)增CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV、FMDV、JEV和PoRV等常見豬病毒的基因，與對(duì)照基因混合后進(jìn)行芯片雜交，掃描后分析結(jié)果，芯片上各病毒靶基因與其目標(biāo)探針有較強(qiáng)雜交信號(hào)、可見斑點(diǎn)清晰，與其他非目的探針基本沒有可見信號(hào)，非目標(biāo)病毒檢測(cè)結(jié)果呈陰性(圖4)。試驗(yàn)結(jié)果表明基因芯片檢測(cè)這10種病毒的方法特異性良好。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2. CSFV PCR產(chǎn)物(247 bp)；3. PRRSV PCR產(chǎn)物(270 bp)；4. TGEV PCR產(chǎn)物(276 bp)；5. PEDV PCR產(chǎn)物(447 bp)；6. SIV PCR產(chǎn)物(229 bp)；7. PRV PCR產(chǎn)物(355 bp)；8. PCV2 PCR產(chǎn)物(472 bp)；9. PPV PCR產(chǎn)物(322 bp)；10. PCMV PCR產(chǎn)物(263 bp)；11. FMDV PCR產(chǎn)物(275 bp)；12. λDNA PCR產(chǎn)物(500 bp)M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2. PCR products (247 bp) of CSFV; 3. PCR products (270 bp) of PRRSV; 4. PCR products (276 bp) of TGEV; 5. PCR products (447 bp) of PEDV; 6. PCR products (229 bp) of SIV; 7. PCR products (355 bp) of PRV; 8. PCR products (472 bp) of PCV2; 9. PCR products (322 bp) of PPV; 10. PCR products (263 bp) of PCMV; 11. PCR products (275 bp) of FMDV； 12. PCR products (500 bp) of λDNA圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR product showed on Agarose gel

2.4 芯片檢測(cè)敏感性試驗(yàn)

測(cè)定各病毒PCR產(chǎn)物濃度，換算成DNA的拷貝數(shù)，將各病毒產(chǎn)物作101～108倍比稀釋后與芯片雜交，掃描結(jié)果分析，各病毒的芯片檢測(cè)敏感性不同，最低檢測(cè)濃度分別如下：CSFV 1.96×105copies·μL-1、PRRSV 2.25×105copies·μL-1、TGEV 3.39×105copies·μL-1、PEDV 2.16×105copies·μL-1、SIV 2.63×105copies·μL-1、PRV 2.68×105copies·μL-1、PCV2 2.93×105copies·μL-1、PPV 2.32×105copies·μL-1、PCMV 3.51×106copies·μL-1、FMDV 1.57×106copies·μL-1，芯片檢測(cè)敏感性結(jié)果表明，該檢測(cè)芯片的最低可檢測(cè)到105copies的病毒。

2.5 芯片穩(wěn)定性檢測(cè)

使用帶標(biāo)記引物分別擴(kuò)增各病毒模板，將混合探針與雜交液混合，進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)。掃描結(jié)果顯示在相同雜交條件下，批次內(nèi)和批次間的芯片熒光信號(hào)值相對(duì)穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果一致，信號(hào)中位值的變異系數(shù)均小于5.26%，檢測(cè)結(jié)果表明同一批次或不同批次的芯片均具有較好可重復(fù)性。

2.6 臨床樣本檢測(cè)

156份臨床樣品中，基因芯片檢測(cè)CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV的陽性率分別為6.41%、3.21%、7.05%、7.69%、5.13%、5.13%、3.85%、4.49%、3.21%，未檢出FMDV感染；混合感染情況與單項(xiàng)PCR/RT-PCR符合率見表3；850份屠宰場(chǎng)樣品中，基因芯片檢測(cè)CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、SIV、PRV、PCV2、PPV、PCMV的陽性率分別為7.53%、4.12%、2.35%、0.59%、0.59%、1.18%、4.71%、1.88%、1.18%，未檢出FMDV感染；混合感染情況與單項(xiàng)PCR/RT-PCR符合率見表4，部分樣品檢測(cè)結(jié)果見圖5。

3 討 論

豬是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是獲得理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的必要前提。基因芯片檢測(cè)方法具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn)[13]，可同時(shí)對(duì)多種病毒基因進(jìn)行檢測(cè)分析，可最大限度保證檢出率，及時(shí)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量水平。

本研究建立的豬病芯片檢測(cè)方法，在一次試驗(yàn)中可同時(shí)檢測(cè)10種豬病毒，有效縮短檢測(cè)時(shí)間。本試驗(yàn)研究的基因芯片為cDNA芯片，并將探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為約200～450個(gè)堿基，各病毒探針之間的同源性均小于46.7%，避免產(chǎn)生堿基錯(cuò)配影響雜交結(jié)果分析保證了該cDNA芯片的特異性和敏感性，并且各病毒探針有相似的Tm值，從而使雜交條件接近芯片上所有靶基因的最佳條件。

芯片雜交屬于固-液相雜交反應(yīng)，影響雜交反應(yīng)的條件包括雜交雙方的濃度和雜交序列特點(diǎn)、雜交的溫度以及時(shí)間、洗滌條件等。一般情況下雜交溫度比靶基因Tm值小5 ～ 10 ℃時(shí)雜交效率高，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的所有探針均有相似的Tm值，均在82～ 94 ℃， 在雜交過程中加入含50%甲酰胺的雜交液可使雜交溫度降低25 ℃，同時(shí)能夠降低雜交背景。本研究的最適雜交溫度為55 ℃，雜交的效果好，雜交斑點(diǎn)清晰可見，信號(hào)值穩(wěn)定。

目前標(biāo)記探針的制備分為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法，間接標(biāo)記法是在擴(kuò)增時(shí)將染料標(biāo)記的底物摻入cDNA，直接標(biāo)記法是引物的5′端加入熒光修飾基團(tuán)，以帶標(biāo)記的引物擴(kuò)增使cDNA帶上標(biāo)記。直接標(biāo)記法迅速、操作簡(jiǎn)單、步驟少，可快速大規(guī)模分析樣品。而間接標(biāo)記法步驟繁多，引入誤差的幾率增大，還需要在摻入標(biāo)記底物的過程中進(jìn)行等優(yōu)化，這些步驟使得間接標(biāo)記的成本要高于直接標(biāo)記。另外，根據(jù)楊國(guó)淋等[14]、馬銳等[15]報(bào)道，采用直接標(biāo)記法的芯片敏感性比間接標(biāo)記法高100倍，因此本研究選擇直接標(biāo)記法進(jìn)行試驗(yàn)。

A.陰性對(duì)照；B. 基因芯片檢測(cè)CSFV結(jié)果；C. 基因芯片檢測(cè)PRRSV結(jié)果；D. 基因芯片檢測(cè)TGEV結(jié)果；E. 基因芯片檢測(cè)PEDV結(jié)果；F. 基因芯片檢測(cè)SIV結(jié)果；G基因芯片檢測(cè)PRV結(jié)果；H. 基因芯片檢測(cè)PCV2結(jié)果；I. 基因芯片檢測(cè)PPV結(jié)果；J. 基因芯片檢測(cè)PCMV結(jié)果；K. 基因芯片檢測(cè)FMDV結(jié)果；L. 基因芯片檢測(cè)JEV、PoRV結(jié)果A. Negative control; B. The gene microarray hybridization result of CSFV; C. The gene microarray hybridization result of PRRSV; D. The gene microarray hybridization result of TGEV; E. The gene microarray hybridization result of PEDV; F. The gene microarray hybridization result of SIV; G. The gene microarray hybridization result of PRV; H. The gene microarray hybridization result of PCV2; I. The gene microarray hybridization result of PPV; J. The gene microarray hybridization result of PCMV; K. The gene microarray hybridization result of FMDV; L. The gene microarray hybridization result of JEV, PoRV圖4 芯片檢測(cè)特異性結(jié)果Fig.4 The specificity of the gene microarray assay

表3臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Table3Statisticsondetectionofclinicalsampleusedforgenechips

病原類型Pathogens陽性樣本Positive sample檢出率/%Detection ratesPCR/RT-PCRGene chipPCR/RT-PCRGene chip符合率/%Coincidence ratesCSFV12107.696.4198.72PRRSV855.133.2198.08TGEV7114.497.0597.44PEDV9125.777.6998.08SIV1086.415.1398.72PRV683.855.1398.72PCV2965.773.8598.08PPV875.134.4999.36PCMV553.213.21100.00FMDV0000100.00CSFV+PRRSV1277.694.4996.79CSFV+PCV29105.776.4199.36PRRSV+PCV27124.497.6997.00PRRSV+TGEV895.135.7799.36TGEV+PCV29115.777.0598.72PCV2+PCMV9125.777.6998.00TGEV+PCV2+PPV855.133.2198.08CSFV+PRRSV+PCV2452.563.2199.36TGEV+PEDV+PCV2+PPV341.922.5699.36CSFV+PRRSV+TGEV+PRV+PCV2442.562.56100.00

表4屠宰場(chǎng)采集樣品850份檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Table4Statisticsondetectionof850samplestakenfromslaughterhouseusedforgenechips

病原類型Pathogens陽性樣本Positive sample檢出率/%Detection ratesPCR/RT-PCRGene chipPCR/RT-PCRGene chip符合率/%Coincidence ratesCSFV74648.707.5398.82PRRSV35354.124.12100.00TGEV31203.652.3598.71PEDV850.940.5999.65SIV750.820.5999.76PRV10101.181.18100.00PCV243405.064.7199.65PPV25162.941.8898.94PCMV14101.651.1899.53FMDV0000100.00

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

圖5 部分臨床樣品芯片檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Screening of clinical specimens by gene chips

應(yīng)用本試驗(yàn)所構(gòu)建的芯片檢測(cè)方法對(duì)隨機(jī)選取的156份臨床發(fā)病樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，所測(cè)樣本中有151份感染病毒，未感染病毒的只占3.21%，單純感染中以冠狀病毒(TGEV、PEDV)陽性率最高均為7%以上，混合感染陽性率達(dá)到50.64%，多以CSFV+PRRSV感染為主，表明臨床上送檢病料中混合感染較為普遍，所有臨床樣本經(jīng)單項(xiàng)PCR/RT-PCR方法驗(yàn)證，芯片檢測(cè)與PCR技術(shù)檢測(cè)的最低符合率為96.79%；應(yīng)用基因芯片對(duì)屠宰場(chǎng)采集的850份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示屠宰場(chǎng)的病毒檢出率比臨床病料的檢出率低，未感染的占28.47%，單純感染占24.11%，其中屠宰場(chǎng)中CSFV、PCV2和PRRSV的檢出率較高，為7.53%、4.71%、4.12%，混合感染中這三種病毒的兩兩混合的檢出率較高，芯片與PCR技術(shù)的檢測(cè)總符合率均在96.79%以上，表明基因芯片適用于高通量檢測(cè)。

本研究所建立的10種病毒基因芯片檢測(cè)試驗(yàn)方法，是建立在PCR/RT-PCR以及核酸特異性雜交的基礎(chǔ)上，暫時(shí)無法區(qū)分各個(gè)病毒強(qiáng)弱毒株，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究[16]。但對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬而言，只要檢出病毒陽性，無論是野毒株還是疫苗株，均應(yīng)立即淘汰。希望本研究所建立的檢測(cè)方法，能夠成為實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制的有力工具。

4 結(jié) 論

建立了檢測(cè)豬常見10種疫病病毒的基因芯片檢測(cè)方法，雜交后熒光信號(hào)清晰、特異性好。芯片檢測(cè)與普通PCR的符合率高于96%。本方法最低可檢測(cè)到105copies的病毒，該方法的建立為實(shí)現(xiàn)多樣品、多病毒的高通量篩查檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)生豬檢疫和實(shí)驗(yàn)用豬質(zhì)量控制均有裨益。

致謝：此研究為國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目，特表感謝。同時(shí)，衷心感謝山東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心給以場(chǎng)地、儀器上的支持，特別感謝中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所的王晨女士在實(shí)驗(yàn)研究過程中的技術(shù)幫助，感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所陳豪泰博士提供豬口蹄疫滅活病毒。