荷丹片對慢性非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的影響

徐麗瑛, 黎硯書, 鄭國安, 吳金花, 丁 琦, 肖小華

(江西省醫(yī)療器械檢測中心, 南昌 330029)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中醫(yī)歸屬于“脅痛”、“痞滿”、“肝脹”、“肝痞”、“肝癖”、“肝著”、“積聚”、“痰證”、“痰濁”、“濕阻”“瘀證”、“肥氣”、“積證”等范疇[1]。其病機為脾腎虧虛，脾虛運化無力，腎虛氣化不利，而致水濕停聚，進而生痰，痰濕內(nèi)蘊，繼而生熱化瘀，而致痰、熱、瘀、濁、濕糾結(jié)，繼而傷肝[1]。荷丹片功能為化痰降濁，活血化瘀，由荷葉、丹參、山楂、番瀉葉、補骨脂五味中藥加工而成，臨床用于高脂血癥屬挾痰濁瘀證侯者。由于臨床應用顯示其對脂肪肝患者有降脂作用，因此現(xiàn)將其進行二次開發(fā)成一種治療脂肪肝的純中藥復方制劑。我們選用高糖高脂灌胃給予大鼠制作NAFLD模型，來探討其治療脂肪肝的藥理作用，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量140～170 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]。飼養(yǎng)于江西省藥物研究所安全評價中心[SYXK(贛)2013-0004]。動物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司[SCXK(京)2014-0010]提供，自由飲食。

1.2 藥品、試劑與儀器

荷丹片，由南昌濟順制藥有限公司提供，每片重0.73 g，含生藥14.125 g，批號： 20160601。血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司，每粒裝0.3g，批號： 20160501。非諾貝特片，上海黃海制藥有限責任公司，規(guī)格，0.1g/片，批號： 160301。血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司，規(guī)格，0.3g/粒，批號： 20160501。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，購自中生北控生物科技股份有限公司; 還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測試盒，購自南京建成生物工程研究所; 膽固醇(C27H40O)，購自上海精析化工科技有限公司; 膽酸鈉，購自北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠; 1,2-丙二醇，購自上海試劑一廠。

電子天平(MP15KC)，購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司; 半自動生化分析儀(BT-224)，購自意大利Biotecnica公司; 石蠟包埋機(TKD-BMC)，購自孝感泰康達醫(yī)療設(shè)備有限公司; 脫水機(TP1020)、輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2126)和攤片機(HI1210)，均購自上海徠卡儀器有限公司; 顯微鏡(Motic BA300)，購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢性NAFLD模型的建立及分組[2-4]將大鼠按體質(zhì)量隨機分成7組, 每組10只, 分別為空白組、模型組、荷丹片低、中、高劑量組、血脂康膠囊組和非諾貝特片組, 再另取同批大鼠5只與模型組大鼠同樣處理。除空白組外, 其余動物均灌胃給予高脂乳劑(玉米油400 g、膽固醇100 g、膽酸鈉33 g、丙二醇300 mL)和高糖溶液(奶粉40 g、蔗糖75 g、蒸餾水100 mL), 灌胃容積均為5 mL/kg,每日1次，連續(xù)8周。于造模4周后，取造模大鼠2只解剖，剖取肝臟作病理切片，驗證大鼠NAFLD模型是否成功；以大鼠肝臟呈灰黃色，鏡檢見中央靜脈周圍的肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，判定為NAFLD造模成功。

1.3.2 給藥 模型成功后，各組大鼠均于每日上午仍繼續(xù)灌胃給予高糖高脂乳劑，下午灌胃給藥，灌胃給藥容積均為10 mL/kg，空白組和模型組給予等容積蒸餾水，1次/日，連續(xù)給藥4周。

1.3.3 觀測指標

1.3.3.1 大體觀察 試驗結(jié)束后處死全部動物，肉眼觀察肝臟顏色、質(zhì)地、大小等情況。

1.3.3.2 生化指標 末次給藥后禁食12 h，經(jīng)大鼠腹主動脈取血, 室溫靜置10 min后, 3 500 r/min離心15 min, 分離血清，按試劑盒說明書操作分別測大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL-C、HDL-C指標。脫頸椎處死大鼠, 剖腹取肝臟稱其濕重, 并取肝臟同部位組織精密稱定0.3 g, 剪碎后加入9倍質(zhì)量分數(shù)0.9%氯化鈉溶液，冰浴中手動制勻漿, 2 000 r/min離心10 min, 取上清液測GSH和MDA含量, 并取肝臟同部位組織精密稱定0.2 g, 剪碎后加入9倍丙酮乙醇(1∶1)溶液中勻漿, 3 500 r/min離心15 min，取上清液測TG、TCH。

1.3.3.3 組織病理學 另取肝臟左葉，用體積分數(shù)10%甲醛固定，HE染色，于光學顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學變化, 拍攝照片。肝損傷病理組織學分級標準如下, 0級： 正常肝組織，無肝細胞變性、壞死, 無炎癥細胞侵潤; I級： 肝小葉內(nèi)肝細胞輕度脂肪變性，偶見肝細胞點狀壞死; Ⅱ級： 肝小葉內(nèi)肝細胞中度脂肪變性，可見肝細胞點狀壞死，炎癥細胞侵潤; Ⅲ級： 肝小葉內(nèi)肝細胞重度彌漫性脂肪變性，點狀壞死多見或可見大片肝細胞壞死。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用DAS 3.0統(tǒng)計軟件對各項血液學指標、生化指標、臟器系數(shù)進行t檢驗，對組織病理學指標進行Ridit檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠肝組織觀察

造模4周后，解剖大鼠，見大鼠肝臟略偏大、表面呈灰黃色。鏡檢見中央靜脈周圍的肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，表明造模成功(圖1A)。

2.2 對NAFLD大鼠肝組織和血清生化指標的影響

造模8周后檢測生化指標，模型組大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL含量明顯高于空白對照組，HDL明顯降低; 荷丹片各劑量組相對模型組上述指標有所改善 (P＜0.05或P＜0.01); 血脂康能顯著降低模型大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL; 荷丹片各劑量能明顯改善大鼠ALT、TCH、HDL、LDL指標水平, 與非諾貝特組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(表 1)。

與空白對照組比較, 模型組大鼠肝組織MDA、TCH、TG含量升高、GSH含量降低(P＜0.01); 與模型組比較，荷丹片能顯著降低模型大鼠肝組織MDA、TCH和TG。差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與非諾貝特組比較，荷丹片能明顯改善大鼠GSH指標水平 (P＜0.05)，詳見表2。

表 1 荷丹片對NAFLD大鼠血液生化指標的影響

表 2 荷丹片對NAFLD大鼠肝組織生化指標的影響

2.3 對肝系數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝系數(shù)增大(P＜0.01); 與模型組比較, 荷丹片對NAFLD大鼠肝系數(shù)無影響, 非諾貝特組大鼠肝系數(shù)增大明顯 (P＜0.01),詳見表3。

表 3 荷丹片對NAFLD大鼠肝系數(shù)的影響

2.4 對NAFLD大鼠肝組織病理學的影響

病理組織學檢查, 空白組肝組織結(jié)構(gòu)正常, 肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，細胞索排列整齊，肝血竇正常, 核圓，位于細胞中央，胞質(zhì)均勻(圖1B); 模型組中央靜脈周圍的肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，肝小葉界限模糊, 小葉內(nèi)出現(xiàn)多個點狀或大片狀壞死，匯管區(qū)見大量炎癥細胞侵潤(圖1C)。荷丹片7.06 g/kg和14.12 g/kg組肝細胞腫脹不明顯, 脂肪變性及炎癥細胞侵潤均較模型對照組顯著減輕, 無大片狀壞死(圖1G、H)。荷丹片3.53 g/kg組時肝細胞腫脹較模型組減輕, 脂肪變性、炎癥細胞侵潤及壞死程度改變不明顯(圖1F)。血脂康0.1 g/kg組肝細胞腫脹，脂肪變性、炎癥細胞侵潤及壞死程度均顯著降低(圖1E)。非諾貝特0.05 g/kg組大鼠肝組織中央靜脈周圍的肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，肝小葉界限模糊, 小葉內(nèi)出現(xiàn)多個點狀及大片狀壞死，匯管區(qū)有炎癥細胞侵潤(圖1D)。肝損傷病理組織學分級結(jié)果見表4。

3 討論

NAFLD是一種無過量飲酒史, 但病理學改變類似酒精性脂肪性肝病，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征[2]，包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化[5,6]。同時現(xiàn)代醫(yī)學認為脂肪肝是肝臟脂蛋白代謝紊亂，甘油三酯的合成速度大于將其泌入血液的速度, TG大量堆積于肝臟而致的一種病理改變[7]。NAFLD目前尚無特效治療藥物，現(xiàn)代醫(yī)學主要是通過改善胰島素抵抗，維持機體內(nèi)環(huán)境脂質(zhì)代謝、能量代謝和抗氧化物的平衡，促使機體保持在適應性反應階段，延緩、阻止脂肪性肝病的病情進展。針對個體病情，可適當采取控制體質(zhì)量的方式輔助治療，終末期肝病需采取肝移植手術(shù)治療。

圖1 荷丹片對NAFLD模型大鼠肝組織病理學影響(HE×100)

表 4 荷丹片對大鼠NAFLD組織病理學的影響

我們采用含高糖高脂組成的乳液給動物灌胃復制的模型具有人類非酒精性脂肪性肝病的重要特征。模型組血脂、肝脂均比空白組顯著增加, 鏡檢顯示肝細胞腫脹, 出現(xiàn)脂肪空泡, 肝小葉內(nèi)出現(xiàn)大片狀壞死, 匯管區(qū)見大量炎癥細胞浸潤, 表明模型成功。

非諾貝特0.05 g/kg劑量能顯著降低脂肪肝模型大鼠血清TG和肝組織TG，顯著增加肝組織GSH;非諾貝特0.05 g/kg增加血清TCH、LDL，降低血清HDL。據(jù)文獻報道，非諾貝特對肝臟有損傷作用，血清ALT、AST均升高[8]; 與試驗結(jié)果一致。非諾貝特0.05 g/kg劑量顯著增加大鼠肝系數(shù)，由于該組大鼠體質(zhì)量顯著降低，且非諾貝特對肝臟造成損傷，肝臟重量增加等原因所致。由于非諾貝特本身對肝臟具有損傷作用，會加重大鼠脂肪肝模型動物肝臟的損傷，解剖可見其肝臟明顯腫大，且呈灰黃色，可能引起其脂質(zhì)代謝紊亂，導致其血液中TCH和LDL增加、HDL下降。

本試驗結(jié)果表明，荷丹片對NAFLD模型大鼠血清生化指標的改變具有明顯改善作用，可降低血脂和肝脂，改善肝病理組織學改變，與陽性對照藥非諾貝特比較，差異有統(tǒng)計學意義，但其劑量組間無明顯差異，無劑量相關(guān)性，其作用機制可能為通過抗氧化作用，抗肝細胞壞死和抑制脂質(zhì)吸收，減少TG合成等因素有關(guān)。