魯 曦， 馬雨哲， 李國花， 張明新， 趙 馨， 劉佩肖， 衛(wèi)飛鵬

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院， 陜西 西安 710100； 3.空軍軍醫(yī)大學(xué) 唐都醫(yī)院， 陜西 西安 710038)

0 引言

腸道菌群從嬰兒出生開始迅速建立[1]，并隨著生長發(fā)育逐步演變，與人體健康密切相關(guān)[2,3].腸道是人體益生菌的重要棲息環(huán)境，早期腸道菌群的定殖對嬰兒的生長發(fā)育至關(guān)重要[4,5].其中，羅伊氏乳桿菌做為哺乳動(dòng)物腸道中的固有微生物黏附于道粘膜層[6,7]，不僅能夠和其他乳酸菌一樣產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物[8]，還能夠分泌羅伊氏菌素[9]、胞外多糖等功能成分，抑制宿主腸道病原體的增殖與黏附，對廣泛的pH環(huán)境與消化作用亦具有較強(qiáng)的耐受力[8,10].因此從健康嬰兒糞便樣本中分離的羅伊氏乳桿菌，更加適應(yīng)人體腸道環(huán)境，不僅利于人體腸道的定殖，而且具有潛在的益生活性.

多項(xiàng)隨機(jī)對照臨床研究發(fā)現(xiàn)[11-14]，羅伊氏乳桿菌DSM 17938能夠在一定程度上緩解嬰兒腸絞痛、降低抗生素相關(guān)腹瀉發(fā)生頻率以及抑制幽門螺桿菌感染.而且，2003年根據(jù)《益生菌類保健食品評審規(guī)定》批準(zhǔn)羅伊氏乳桿菌為可用于保健食品的益生菌菌種；2014年更新可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告同意羅伊氏乳桿菌(菌株號DSM17938)用于嬰幼兒食品.雖然羅伊氏乳桿菌具有顯著的益生功能，但目前菌種產(chǎn)權(quán)集中在瑞典等國，因此分離篩選出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的羅伊氏乳桿菌菌種，并對其安全性、有效性進(jìn)行評價(jià)，為開發(fā)出適宜國人腸道健康和人群特點(diǎn)益生菌產(chǎn)品提供菌種資源具有重要意義[15,16].

腸毒性大腸桿菌(ETEC)是發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉的要病原體，且缺乏有效疫苗.造成了全球每年2億人次感染、38萬5歲以下兒童死亡，嚴(yán)重威脅著人類健康[17-20].

鑒于羅伊氏乳桿菌益生特性與ETEC的危害，本研究從健康嬰兒糞便樣本中分離羅伊氏乳桿菌，并在體外評價(jià)其耐酸耐膽鹽能力，并對具有ETEC的抑制功能的菌株進(jìn)行篩選.該研究對緩解嬰兒ETEC腹瀉、促進(jìn)腸道健康具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

來自某母嬰護(hù)理中心的24份健康嬰兒新鮮糞便樣本，該研究通過空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會許可(201903-29)，并獲得被試者知情同意；羅伊氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 DSM17938；腸毒性大腸桿菌 H10407為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

牛肉膏、酵母膏購于北京奧博星生物技術(shù)公司；蛋白胨購于牛津有限責(zé)任公司；纖維二糖、水楊苷、山梨醇、麥芽糖、溴甲酚紫購于北京夢怡美生物科技有限公司；無菌無酶水、50×TAE緩沖液(pH8.0)購于陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；引物27F、引物1492R由生工生物工程股份有限公司合成；2×pro Taq Master mix(dye plus)、GL DNA Marker 2000、瓊脂糖凝膠購于艾科瑞生物工程有限公司.?；敲撗跄懰徕c購自上海源葉生物科技有限公司.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-303-4B電熱恒溫培養(yǎng)箱，浙江力辰儀器科技有限公司； YDS-10-80液氮生物容器，樂山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司；TC1000-G PCR梯度基因擴(kuò)增儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BM2000生物顯微鏡，南京麥迪森儀器有限公司；DW-YL270 醫(yī)用低溫箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；721型分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本的采集和處理

嬰兒背景信息：本研究樣本采集對象為出生1～7周內(nèi)，體重在2.4～3.5公斤的嬰兒，每個(gè)嬰兒采集大約1g的糞便樣本.其中男嬰占60.9%，女嬰占30.1%.

樣本采集：使用一次性無菌拭子在嬰兒肛周采集新鮮糞便樣本，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基(硫乙醇酸鈉1.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，Na2HPO41.1 g/L，CaCl20.09 g/L，瓊脂 1.0 g/L，pH 8.4±0.1)，4 ℃運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室立即分離鑒定.樣本處理：將帶有新鮮糞便樣品的拭子放入1 mL滅菌生理鹽水渦旋30～60 s，制成均勻的樣本懸液并進(jìn)行10倍系列稀釋.

1.2.2 菌株的分離純化

取不同稀釋度200μL均勻的涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基(10.0 g蛋白胨，10.0 g牛肉膏，5.0 g酵母膏，2.0 g(NH4)2HC6H5O7，20.0 g 葡萄糖，1.0 mL 吐溫 80，5.0 g CH3COONa·3H2O，2.0 g K2HPO4·3H2O，0.50 g MgSO4·7H2O，0.25 g MnSO4·H2O，15.0 g 瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，pH 6.4±2)上，37 ℃下培養(yǎng)72 h，對可疑菌落在新鮮MRS平板上重新劃線繼續(xù)分離培養(yǎng)72 h，隨后每個(gè)平板挑取3個(gè)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性菌后，接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)鑒定.

1.2.3 菌株的鑒定

(1)形態(tài)特征觀察

對疑似乳酸菌的菌株在MRS平板劃線分離，觀察菌落顏色、質(zhì)地、直徑；革蘭氏染色菌體顏色、形狀.

(2)生化鑒定

按照GB4789.35 生化鑒定方法[21]，進(jìn)行纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷、蔗糖、棉子糖發(fā)酵試驗(yàn)等生化檢測，根據(jù)顏色變化判斷陰性(黃色)或陽性(紫灰色).

(3) 16S rRNA的擴(kuò)增和序列分析

PCR反應(yīng)：首先取菌液1 mL 12 000 r/min離心3 min，棄上清液.在沉淀物中加入400μL無菌蒸餾水重懸，100 ℃加熱5 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液即為模板DNA.隨后按照2×pro Taq說明書，配制反應(yīng)液，包含：10μL 2× pro Taq Master mix，0.2μL上下游引物(通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，1μL模板DNA，去離子水(DW)補(bǔ)充至20μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)條件見表1所示.

表1 PCR反應(yīng)條件

16S rRNA測序及BLAST對比：本研究委托生工生物工程股份有限公司對PCR樣本進(jìn)行測序.對測序得到的序列結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，將序列相似度>97%的配對結(jié)果作為菌株的鑒定結(jié)果[19].進(jìn)一步，下載羅伊氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株16S rRNA序列，利用MEGA7.0系統(tǒng)發(fā)育軟件，使用鄰接算法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其具體種屬.

1.2.4 耐酸耐膽鹽特性評價(jià)

首先使用1 M鹽酸將MRS肉湯培養(yǎng)基pH調(diào)整為2和3，并在滅菌后復(fù)測pH.另外，用過濾除菌法配置膽鹽(牛黃脫氧膽酸鈉)母液，再添加到滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，使膽鹽終濃度分別為0.3%和1%.隨后，將過夜培養(yǎng)的羅伊氏乳桿菌按1∶100接種至不同pH或不同膽鹽濃度的的MRS肉湯培養(yǎng)基4 mL，并以pH=6.5和不含膽鹽的MRS肉湯做為對照條件，37 ℃培養(yǎng)0～4 h，取100μL用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù).

1.2.5 ETEC抑菌功能評價(jià)

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，具體方法如下：首先挑取ETEC單菌落，接種到LB肉湯培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h.測量菌液在600 nm處吸光度，并稀釋至OD600 nm=1.取稀釋過后的ETEC 菌液100μL，均勻涂布在含有1.5%瓊脂的的LB平板上，隨后在上述LB平板上分散放置5個(gè)牛津杯,倒入1% LB瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后將牛津杯取出.接著，將本研究分離得到，并且提前活化好的羅伊氏乳桿菌，取其發(fā)酵上清液100μL 加入孔內(nèi)，37 ℃下培養(yǎng)48 h[20]觀察測量抑菌圈直徑.

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)均為三次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著水平為α=0.05.利用GraphPad 7繪制統(tǒng)計(jì)圖表.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離與鑒定結(jié)果

鑒定流程與結(jié)果參見圖1所示.本研究從24例健康嬰兒糞便樣本中利用MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，并連續(xù)劃線分離，共得到183株乳酸菌可疑菌株，菌落特征信息參見表2所示.按照GB4789.35中糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)檢測上述菌株對碳源的利用能力，生化鑒定法初步鑒定出：副干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌25株、嗜酸乳桿菌32株、羅伊氏乳桿菌1株、植物乳桿菌59株.

圖1 乳酸菌分離流程初步鑒定結(jié)果

表2 可疑乳酸菌菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果

此外，本研究還利用27F和1492R通用引物對上述菌株16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，將序列進(jìn)行BLAST比對.

初步鑒定出羅伊氏乳桿菌5株，加氏乳桿菌2株.本研究發(fā)現(xiàn)：生化鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果差異較大，這種不一致的現(xiàn)象與前人研究結(jié)果類似[22],微生物對生化底物利用能力存在一定交叉，是造成這種差異的可能原因之一，本研究采用了測序結(jié)果最為鑒定的最終結(jié)果.

2.2 進(jìn)化樹分析結(jié)果

本研究將5株初步鑒定的羅伊氏乳桿菌(GH221-4、GH319-13、GH812-16、GH812-17和GH329-22)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到長度大約1456 bp的16S RNA基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中部分乳酸菌16S RNA基因序列，利用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.由發(fā)育樹(圖2)可知：菌株GH812-16與GH812-17同源性為99%，它們與羅伊氏乳桿菌(AAA64571.1)同源性為97%；GH211-13和GH319-4與羅伊氏乳桿菌(NR075036)親緣關(guān)系最為接近，同源性分別為96%和95%；此外GH329-22與ABB02610.1親緣關(guān)系最為接近，同源性為98%.

圖2 菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 耐酸耐膽鹽能力

益生菌發(fā)揮功能的主要場所是腸道，因此需要耐受消化系統(tǒng)的酸性和膽鹽環(huán)境.食物通過人體胃部消化時(shí)間一般<4 h；而正常人體胃液pH介于2～3之間波動(dòng)[22,23]；人體十二指腸內(nèi)膽鹽濃度為0.3%左右.本研究選擇pH為2.0和3.0、膽鹽含量為0.3%和1%進(jìn)行耐酸耐膽鹽能力測試.

耐酸結(jié)果如圖3所示：本研究分離到的5株羅伊氏乳桿菌在pH=6.5(Control組)條件下，干預(yù)4 h后活菌數(shù)相比0 h顯著提高(P<0.05).而在pH=3和pH=2條件下干預(yù)4 h，只有GH211-4號菌的活菌數(shù)隨時(shí)間顯著提高(P<0.05)，GH319-13、GH812-17和GH329-22活菌數(shù)維持不變(P>0.05).在pH=2處理4 h后，5株羅伊氏乳桿菌活菌數(shù)相比對照條件(pH=6.5)均發(fā)生顯著下降(P<0.05)，但GH211-4和GH319-13在該條件下活菌率相對其他3株較高(P<0.05).

圖3 羅伊氏乳桿菌耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 羅伊氏乳桿菌耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

耐膽鹽結(jié)果如圖4所示：在膽鹽濃度為1%處理4 h后僅有GH329-22號活菌數(shù)與對照條件相比無顯著差異(P>0.05)，其余4株活菌數(shù)在該條件下均被顯著抑制(P<0.05).但是，在膽鹽濃度為0.3%處理4 h的條件下，除GH812-17號菌之外，其余4株活菌數(shù)相比對照組均無顯著差異(P>0.05).

羅伊氏乳桿菌對酸性與膽鹽環(huán)境耐受是其重要益生特征之一[8]，本研究分離到的5株羅伊氏乳桿菌雖然對酸性與膽鹽環(huán)境均具有一定耐受性，但存在一定差異,例如GH329-22能夠耐受4 h，1%膽鹽環(huán)境，但pH=3處理4 h后，活菌數(shù)卻發(fā)生顯著下降.綜合上述結(jié)果，GH211-4和GH812-13號能夠同時(shí)對酸性與膽鹽環(huán)境具有一定的耐受力.

2.4 對ETEC抑制效果

本研究利用牛津杯法測試了羅伊氏乳桿菌MRS發(fā)酵上清液對ETEC抑菌效果，結(jié)果如圖5所示，其中GH612-16號菌抑菌圈直徑為10.35±0.72 mm，顯著高于對照組(6.0±0.13 mm).提示該菌可能對ETEC具有一定的抑菌能力.

圖5 5株羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液對ETEC的抑制功能

ETEC是一種導(dǎo)致嬰兒腹瀉和仔豬腹瀉的致病微生物，而抗生素是治療其感染常規(guī)手段.但是抗生素除了可能導(dǎo)致菌體耐藥之外，還可以通過破壞腸道菌群結(jié)構(gòu)與穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而損傷腸道功能.因此抗生素替代療法將成為未來新型抗菌技術(shù)發(fā)展的重要方向之一.

羅伊氏乳桿菌可以通過分泌羅伊氏菌素、胞外多糖等功能成分對常見病原體，例如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有明顯的抑制效果，而且對輪狀病毒引起的腸炎具有明顯的改善作用.

篩選得到的人源性羅伊氏乳桿菌可以作為一種益生菌源用于后續(xù)益生菌產(chǎn)品開發(fā)，根據(jù)可用于嬰幼兒食品的菌種名單，羅伊氏乳桿菌可被添加到嬰兒食品中，幫助嬰兒改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高嬰兒免疫力.

3 結(jié)論

本研究從24例健康嬰兒糞便樣本中分理處5株羅伊氏乳桿菌，均具有一定的酸性與膽鹽環(huán)境的耐受性，其中GH211-4和GH319-13能夠?qū)H=3和0.3% 膽鹽處理4 h的試驗(yàn)條件具能較好耐受.此外，本研究還篩選出1株對ETEC具有顯著抑制功能的羅伊氏乳桿菌(GH812-16)，能夠在pH=2 和0.3%膽鹽環(huán)境中耐受2 h，該菌為緩解嬰兒ETEC腹瀉、促進(jìn)腸道健康具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義.

腸道菌群的建立對嬰兒生長發(fā)育至關(guān)重要，而羅伊氏乳桿菌做為一種天然存在于人體腸道的共生微生物而且具有抑制致病菌、促進(jìn)腸道免疫細(xì)胞分化和免疫調(diào)節(jié)的功能.然而，由于人群個(gè)體差異和菌種差異的不同，使得目前益生菌臨床研究喜憂參半，因此對功能菌株的篩選與鑒定至關(guān)重要.