崔菲菲，孟 川，2，王彥華，趙建軍，陳雪平，申書(shū)興，顧愛(ài)俠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北 石家莊 050051)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)分析基因表達(dá)及調(diào)控，對(duì)于解析植物各種復(fù)雜的生物代謝途徑和遺傳性狀及逆境脅迫生理響應(yīng)具有重要的意義[1]。在利用qRT-PCR技術(shù)中，為了消除或降低不同組織間因RNA的提取質(zhì)量、初始模板量或者反轉(zhuǎn)錄效率等所造成的偏差，必須選擇適宜的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[2]。選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因也是保證其分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要前提條件[3-4]。目前，Actin、GAPDH、18SrRNA、Ubiquitin等內(nèi)參基因已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于qRT-PCR分析。然而，近年來(lái)大量的研究結(jié)果表明，任何一個(gè)內(nèi)參基因不能夠適用于所有條件下的試驗(yàn)研究[5-8]。所謂的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)都只是限定在一定類型的細(xì)胞或試驗(yàn)因素作用下“有范圍”的恒定[9-12]。據(jù) Gutierrez等[13]報(bào)道，使用未經(jīng)驗(yàn)證的內(nèi)參基因，目標(biāo)基因表達(dá)水平的定量會(huì)出現(xiàn)100倍的偏差。因此，在利用qRT-PCR進(jìn)行定量分析之前，在不同試驗(yàn)材料或不同試驗(yàn)條件中，有必要驗(yàn)證、篩出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，作為每個(gè)試驗(yàn)研究所適用的最佳內(nèi)參基因穩(wěn)定的定量因子。

本研究利用geNorm[14]和NormFinder[15]統(tǒng)計(jì)軟件，比較分析了21個(gè)候選內(nèi)參基因在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的幼苗期、蓮座期、包心期、結(jié)球期，及包心期IAA和TIBA處理的葉片和生殖生長(zhǎng)階段6個(gè)大小不同等級(jí)的花蕾的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性，旨在為精確分析大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系的基因表達(dá)提供保障，同時(shí)也為蕓薹屬植物不同發(fā)育時(shí)期及激素處理對(duì)內(nèi)參基因的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的添加結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)4號(hào)染色體片段、基因型純合的大白菜(Brassicarapassp.pekinensis)易位系B3-29，于2015年8月8日播種于溫室，進(jìn)行育苗，9月12日進(jìn)行田間定植。分別在幼苗期、蓮座期、包心期和結(jié)球期的幼嫩葉片進(jìn)行取材。并在包心期分別噴施生長(zhǎng)素IAA(0.2，0.6，1.2 mmol/L)和生長(zhǎng)素抑制劑TIBA(0.5，1.0，1.5 mmol/L)，處理后12 h進(jìn)行幼嫩葉片取材。2016年春季，待其抽薹開(kāi)花取花蕾，分為6個(gè)階段，花發(fā)育階段1(花蕾橫徑介于1～2 mm)、花發(fā)育階段2(花蕾橫徑介于2 ～3 mm)、花發(fā)育階段3(花蕾橫徑大于3 mm，長(zhǎng)度大于4 mm)、花發(fā)育階段4(花蕾橫徑大于4 mm，長(zhǎng)度大于5 mm)、花發(fā)育階段5(花冠露出尚未伸展)、花發(fā)育階段6(開(kāi)花當(dāng)天)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。所有樣品液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

本研究共檢測(cè)了21個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性：腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶基因(Adeninephosphoribosyl transferase，Apr)、液泡膜內(nèi)在蛋白基因(Tonop last intrinsic proteins，BcTIP41)、未知功能基因(Unknown protein，U34559)、延伸因子1基因(Elongationfactor1α，EF1α)、微管蛋白基因(Tubulin beta，TUB4)、親環(huán)蛋白基因(Cyclophilin，CYP)、鋅指蛋白基因(DnaJ-Like，DNAJ)、組蛋白基因(Histone h3，HIS)、α-微管蛋白基因(Alpha tubulin 5，TUA5)、假設(shè)蛋白基因(Hypothetical，UKN1)、互作蛋白基因(Ask-interacting protein 16，SKIP16)、網(wǎng)格銜接蛋白復(fù)合體基因(Clathrin adaptor complex，CAC)、肌動(dòng)蛋白基因3個(gè)同源基因(ACTIN、ACTIN-1、ACTIN-2)、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(Glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、泛素結(jié)合酶基因(Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC30)、泛素連接酶基因(Poly ubiquitinenzyme，UBQ)、三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域基因(Pentatricopeptide repeat，PPR)、蛋白磷酸酶2A基因(Protein phosphatase 2A gene，PP2A)、蘋果酸脫氫酶基因(Malate dehydrogenase，MDH)所有引物序列見(jiàn)表1。將樣品的cDNA進(jìn)行5個(gè)濃度梯度稀釋，優(yōu)化反應(yīng)條件，確定檢測(cè)樣品的稀釋濃度。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA模板 2 μL，正反向引物(50 ng/μL)各0.5 μL，ddH2O 7 μL，THUN-DERBIRD SYBR qPCR Mix(QPS-201(-)TOYOBO公司)10 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火10 s，68 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)；之后65～95 ℃熔解曲線分析。每個(gè)樣品均3次重復(fù)。試驗(yàn)使用羅氏LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。本試驗(yàn)所用試劑IAA和TIBA購(gòu)于SIGMA公司，純度大于98%。用RNA提取試劑盒ESAYspin Plus(北京艾德萊公司)分別提取樣品總RNA。反轉(zhuǎn)錄根據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。

表1 內(nèi)參引物序列Tab.1 Primers used for candidate reference genes

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用常用的內(nèi)參分析軟件geNorm(ver. 3.5)和NormFinder(ver. 0.953)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果中Ct值，利用公式Q=E-ΔCt，計(jì)算出各基因的相對(duì)表達(dá)量Q[20]。利用geNorm軟件對(duì)各候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量Q進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，M值越小，穩(wěn)定性越高。利用標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析(V)，確定合適的內(nèi)參基因數(shù)目。該程序默認(rèn)V值為0.15，若Vn/n+1>0.15，則引入第n+1個(gè)內(nèi)參基因[14]。NormFinder軟件通過(guò)方差分析得出基因的表達(dá)穩(wěn)定值M，直接評(píng)價(jià)基因的穩(wěn)定性[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因表達(dá)水平

對(duì)于21個(gè)候選內(nèi)參基因，通過(guò)計(jì)算Ct值來(lái)比較基因的表達(dá)豐度，結(jié)果表明，試驗(yàn)涉及的21個(gè)內(nèi)參基因在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系不同類型材料中的平均Ct值為17.28～31.98(表2，3)，并且大部分Ct值都集中在20.00～25.00，可用于后續(xù)試驗(yàn)。其中，GAPDH和MDH表達(dá)量較高，Ct值分別在19.00和20.00左右，PPR表達(dá)量較低，Ct值在30左右。從所有材料中的21個(gè)內(nèi)參基因平均Ct值的箱式圖中可以看出(圖1)，GAPDH和SKIP16基因的平均Ct值的最大值與最小值浮動(dòng)范圍較大。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR分析中21個(gè)候選基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和激素處理的平均Ct值Tab.2 Mean Ct values of 21 reference genes across vegetative growth stage and hormone treatment experimental in qRT-PCR

注：IAA和TIBA處理濃度單位為mmol/L。

Note：The concentration unit of IAA and TIBA treatment is mmol/L.

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 geNorm 分析 通過(guò)geNorm軟件計(jì)算在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系不同樣品中各候選內(nèi)參基因表達(dá)的M值，進(jìn)行穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示(表4)，在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)的不同時(shí)期或是在IAA和TIBA激素處理后，各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性有明顯差異。在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段幼苗期、蓮座期、包心期和結(jié)球期UKN1和TUB4基因表達(dá)較為穩(wěn)定。在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系包心期用不同濃度生長(zhǎng)素IAA處理后，均表現(xiàn)出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)锽cTIP41和ACTIN。用不同濃度生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理后，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為UKN1和BcTIP41。生殖生長(zhǎng)時(shí)期花發(fā)育階段的6個(gè)等級(jí)大小花蕾中最穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)镈NAJ和ACTIN，其次為PP2A。在總樣品分析中認(rèn)為，內(nèi)參基因?yàn)锽cTIP41和U34559較為穩(wěn)定，其次為ACTIN，而內(nèi)參基因SKIP16、GAPDH和MDH表現(xiàn)不穩(wěn)定。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中21個(gè)候選基因在花蕾發(fā)育階段的平均Ct值Tab.3 Mean Ct values of 21 reference genes across floral development stage experimental in qRT-PCR

箱式圖中線表示Ct值的中位數(shù)。內(nèi)部小方塊代表均值。上面四分之三、下面四分之一位數(shù)；上緣值和下緣值表示Ct數(shù)據(jù)中的極大值和極小值。 The line across the box depicts median. The inside box depicts mean. The outside box is determined by the 25th and 75th percentiles;The whiskers indicate the maximum and minimum values.

為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的RT-qPCR分析結(jié)果，通常會(huì)使用2個(gè)或更多內(nèi)參基因進(jìn)行校正。利用geNorm軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析(V)，確定各組合樣品中最佳內(nèi)參基因數(shù)目，由圖2結(jié)果可知，對(duì)總樣品分析中，V3/4的值是0.12，小于界限值0.15。因此，在總樣品分析中，一組最優(yōu)的穩(wěn)定的內(nèi)參基因至少需要3個(gè)，分別為：BcTIP41、U34559和ACTIN。同時(shí)花發(fā)育階段組合V3/4的值是0.14，小于界限值0.15，表明在花發(fā)育階段也需選用3個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分別為：DNAJ、ACTIN和PP2A。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和激素處理后材料的V2/3的值均小于界限值0.15，故只需選用2個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段(從幼苗到結(jié)球)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁KN1和TUB4。在包心期用不同濃度生長(zhǎng)素IAA處理后，內(nèi)參基因BcTIP41和ACTIN最為穩(wěn)定，用不同濃度生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理后，內(nèi)參基因UKN1和BcTIP41最為穩(wěn)定。

2.2.2 NormFinder軟件分析 為了進(jìn)一步驗(yàn)證geNorm分析的結(jié)果，筆者也使用了NormFinder軟件進(jìn)行穩(wěn)定性分析。2個(gè)軟件推薦的最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的基因比較一致(表4)，如：在2個(gè)軟件的分析顯示，在總樣品、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的幼苗期到結(jié)球期、生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理后推薦的最為穩(wěn)定的和最不穩(wěn)定內(nèi)參基因相一致。而在生長(zhǎng)素IAA處理后最穩(wěn)定內(nèi)參基因BcTIP41的排名在2個(gè)軟件存在一些差別，在geNorm軟件中與ACTIN基因的M值相同排在第1位，而NormFinder軟件分析卻排在第4位，但是BcTIP41的M值與排在第2位基因僅相差0.06。在花發(fā)育階段也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，但是M值之間差距較小。

表4 geNorm和NormFinder分析21個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值(M)Tab.4 Gene expression stability of 21 candidate genes as predicted by geNorm and NormFinder

注：括號(hào)中為穩(wěn)定性排序。

Note：Stability ranking in parenthese.

當(dāng)Vn/n+l<0.15時(shí)，優(yōu)化的內(nèi)標(biāo)基因個(gè)數(shù)為N。 When Vn/n+1 < 0.15 then the optimal number of reference genes is N.

3 討論與結(jié)論

目前，在多數(shù)植物中都鑒定出了各自在不同的試驗(yàn)條件下表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，包括大豆(Glycinemax)、小擬南芥(Arabidopsispumila)、野生條斑紫菜(Pyropiayezoensis)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、菊花(Chrysanthemumlavandulifolium)、鼠尾草(Salviahispanica)、茄子(SolanummelongenaL.)[21-27]。研究結(jié)果表明，內(nèi)參基因GAPDH在葡萄(Vitisamurensis)和荔枝(LitchichinensisSonn.)中表達(dá)均較穩(wěn)定，而在黑麥草(Loliumperenne)、芥菜(Brassicajuncea)、柳枝稷(PanicumvirgatumL.)中的表達(dá)穩(wěn)定性則較差[28-32]。在菊花中能夠穩(wěn)定表達(dá)的SKIP16，在大白菜花的發(fā)育中則穩(wěn)定性較低[18]。李晗等[33]報(bào)道，在羽衣甘藍(lán)的不同組織中GAPDH為最不穩(wěn)定內(nèi)參基因。本研究中，GAPDH和SKIP16基因在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉球發(fā)育過(guò)程中及IAA和TIBA處理后都不能穩(wěn)定表達(dá)。表明在不同物種中，同一內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性各不相同。

本研究大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系不同發(fā)育階段、不同組織部位以及不同激素處理?xiàng)l件下，21個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性也各不相同。Zhang等[34]對(duì)麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)內(nèi)參基因分析，認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段ACT和TUB8內(nèi)參基因最穩(wěn)定，在生殖生長(zhǎng)階段內(nèi)參基因GAPDH和EF-1α最為穩(wěn)定。吝月愛(ài)[35]在玉米的不同組織中認(rèn)為，內(nèi)參基因TUB、UBQ9和EF1lα是莖中最穩(wěn)定；EF1α、UBQ9和GAPDH是葉片中最穩(wěn)定；在激素處理?xiàng)l件下，EF1α、TUB和GAPDH在脫落酸處理?xiàng)l件下最穩(wěn)定；ACT2和TUB是赤霉素處理?xiàng)l件下最穩(wěn)定。劉洪峰等[24]在牡丹內(nèi)參基因篩選時(shí)，認(rèn)為不同組織(莖、葉片、花萼、花瓣)中內(nèi)參基因AMPDS和PUF1639最為穩(wěn)定，在不同發(fā)育時(shí)期的種子中認(rèn)為RPS9和PUF1639基因最為穩(wěn)定。進(jìn)一步證明了同一植物中的不同發(fā)育階段、不同組織部位及不同處理?xiàng)l件下，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不盡相同。

Cheng等[18]對(duì)13個(gè)內(nèi)參基因在不結(jié)球大白菜花的不同發(fā)育階段及不同花器官組織部位中進(jìn)行內(nèi)參基因篩選，其中，DNAJ、UKN1和PP2A被確定為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本研究對(duì)大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系花發(fā)育階段的6個(gè)等級(jí)大小的花蕾進(jìn)行21個(gè)內(nèi)參基因篩選發(fā)現(xiàn)，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镈NAJ、ACTIN和PP2A，與Cheng等[18]研究結(jié)果相似。本研究選擇的內(nèi)參基因在包含了Cheng等[18]研究的12個(gè)內(nèi)參基因基礎(chǔ)上，又增加了9個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，共21個(gè)內(nèi)參基因，其中，DNAJ和PP2A在不結(jié)球大白菜、大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系的花器官中都表現(xiàn)了高穩(wěn)定性，表明該研究不僅為大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系基因表達(dá)量的精準(zhǔn)分析提供了必要保障，同時(shí)也為蕓薹屬其他植物內(nèi)參基因的選擇提供了參考。

在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段(從幼苗到結(jié)球)內(nèi)參基因UKN1和TUB4表達(dá)最為穩(wěn)定。生長(zhǎng)素IAA處理后，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)锽cTIP41和ACTIN，生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理后，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁KN1和BcTIP41。在花發(fā)育階段6個(gè)大小等級(jí)花蕾中DNAJ、ACTIN和PP2A基因表達(dá)穩(wěn)定。內(nèi)參基因GAPDH和MDH在大白菜-結(jié)球甘藍(lán)易位系的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段、激素IAA和TIBA處理及花發(fā)育階段表達(dá)均不穩(wěn)定。