蘇有科，袁雪梅，王 敏，藏金萍，曹宏哲，張 康，董金皋，張 靖，邢繼紅

(河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

灰葡萄孢是目前研究較為深入植物病原真菌之一，它能夠引起500多種植物的灰霉病，常常對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響，由灰霉病造成的世界經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)千億美元[1-3]。隨著灰葡萄孢基因組序列的發(fā)布，灰葡萄孢已經(jīng)成為植物-病原物互作研究的模式真菌[4-5]。灰葡萄孢致病相關(guān)基因的挖掘及其致病機(jī)制的研究，可為闡明灰葡萄孢致病機(jī)制及灰霉病的防治提供理論依據(jù)。

灰葡萄孢M(jìn)APK信號(hào)途徑在病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[6-7]。灰葡萄孢M(jìn)APK信號(hào)途徑包括3種類(lèi)型的MAP激酶編碼基因bmp1[8]、bmp3[9-10]和BcSak1[11]。bmp1基因的缺失突變體Δbmp1生長(zhǎng)速率減慢，分生孢子的產(chǎn)量降低，分生孢子能夠在寄主植物表面萌發(fā)，但不能穿透寄主組織，在西紅柿葉片上和康乃馨的花朵上均不能產(chǎn)生致病斑[7-8]。bmp3基因的缺失突變體Δbmp3在低滲透壓的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率減慢，完全喪失了產(chǎn)孢能力和產(chǎn)菌核能力[9-10]。BcSak1基因的缺失突變體ΔBcSak1的生長(zhǎng)速度下降，不能產(chǎn)生分生孢子，菌核產(chǎn)生量增加，不能穿透寄主組織，致病力明顯降低[11]。bmp3和BcSak1下游的BcReg1基因與致病力也密切相關(guān)，突變體Δbcreg1不產(chǎn)生分生孢子，能夠穿透植物組織但不能形成致病斑[12]。TCHK-MAPK信號(hào)途徑中BOS4、BOS5、BOS2與致病力密切相關(guān)，其敲除突變體致病力均完全喪失，BOS5敲除突變體菌絲的生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型菌株，雖能夠穿透寄主細(xì)胞，但是菌絲的形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重畸形[13]。此外，bmp1下游的Ste12轉(zhuǎn)錄因子也與病菌的侵染密切相關(guān)[14-15]。

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期獲得了灰葡萄孢致病基因BcKMO，該基因編碼犬尿氨酸單氧酶(Kynurenine 3-monooxygenase，KMO)[16]；利用基因互補(bǔ)技術(shù)，明確了BcKMO基因正調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育，負(fù)調(diào)控病菌的致病力[17]，確定了BcKMO基因通過(guò)調(diào)控病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力、致病相關(guān)基因及信號(hào)途徑基因的表達(dá)而影響病菌的致病力[18]。但是該基因與病菌MAPK信號(hào)途徑之間的關(guān)系尚未明確。

本研究通過(guò)檢測(cè)BcKMO基因突變體對(duì)MAPK信號(hào)途徑抑制劑的敏感性、BcKMO基因與MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律、BcKMO基因突變對(duì)MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，以及MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因突變對(duì)BcKMO基因表達(dá)的影響，確定BcKMO基因與MAPK信號(hào)途徑之間的關(guān)系，旨在為闡明灰葡萄孢BcKMO基因調(diào)控病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO基因的T-DNA插入突變體BCG183、回復(fù)突變體BCG183/BcKMO、MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因bmp1和bmp3的RNAi突變體菌株，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 BcKMO基因突變體對(duì)MAPK信號(hào)途徑抑制劑的敏感性檢測(cè)

將野生型BC22、突變體BCG183和BCG183/BcKMO分別接種到含有MAPK信號(hào)途徑特異性抑制劑U0126的PDA培養(yǎng)基上，U0126終濃度為10 μmol/L，20 ℃條件下培養(yǎng)，觀測(cè)病菌菌落的生長(zhǎng)速率。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。每個(gè)處理至少重復(fù)3次。

1.3 BcKMO、bmp1和bmp3的表達(dá)規(guī)律分析

1.3.1 病菌不同發(fā)育階段、不同部位的基因表達(dá)規(guī)律分析 分別提取灰葡萄孢野生型BC22的菌絲生長(zhǎng)時(shí)期、分生孢子時(shí)期和菌核時(shí)期的菌絲、分生孢子和菌核的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Tubulin基因作為內(nèi)參，利用Real-time PCR技術(shù)，分析BcKMO和MAPK途徑關(guān)鍵基因bmp1、bmp3的表達(dá)情況。反應(yīng)體系(10 μL)：模板cDNA 1.0 μL、Mix(5 U/μL) 5 μL、引物(10 μmol/L) 0.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)BcKMO、bmp1和bmp3表達(dá)的影響 將灰葡萄孢野生型BC22分別接種在含蔗糖、甘油、果糖、葡萄糖的YEB培養(yǎng)基中，在20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Tubulin基因作為內(nèi)參，利用Real-time PCR技術(shù)來(lái)分析BcKMO、bmp1和bmp3的表達(dá)情況。反應(yīng)體系和程序同上。

1.4 BcKMO基因突變體中bmp1和bmp3的表達(dá)分析

利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型菌株BC22、突變體BCG183和BCG183/BcKMO中bmp1、bmp3基因的表達(dá)水平。分別以BC22、BCG183、BCG183/BcKMO的cDNA為模板，以Tubulin基因?yàn)閮?nèi)參，用bmp1和bmp3基因的特異性引物(表1)進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。

1.5 bmp1和bmp3基因的RNAi突變中BcKMO的表達(dá)分析

利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)bmp1和bmp3基因RNAi突變體中BcKMO的表達(dá)水平。以bmp1和bmp3基因RNAi突變體的cDNA為模板，Tubulin基因?yàn)閮?nèi)參，用BcKMO基因特異性引物(表1)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

表1 Real-time PCR引物設(shè)計(jì)Tab. 1 Real-time PCR primers design

2 結(jié)果與分析

2.1 BcKMO基因突變體對(duì)MAPK信號(hào)途徑抑制劑的敏感性檢測(cè)

檢測(cè)野生型BC22、突變體BCG183和BCG183/BcKMO對(duì)MAPK信號(hào)途徑特異性抑制劑U0126的敏感性，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183對(duì)抑制劑U0126的敏感性顯著低于野生型和回復(fù)突變體，抑制率測(cè)定結(jié)果也確定突變體BCG183受抑制的程度顯著降低(圖1)。

不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖2-5同。 Different letters mean significant difference at P < 0.05 level. The same as Fig.2-5.

2.2 BcKMO、bmp1和bmp3的表達(dá)規(guī)律分析

2.2.1 病菌不同發(fā)育階段、不同組織部位的基因表達(dá)分析 利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)BcKMO和bmp1、bmp3在病菌不同發(fā)育階段、不同部位的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcKMO和bmp1、bmp3在菌絲、分生孢子和菌核中均有所表達(dá)，BcKMO在6～8 d的菌絲和菌核中表達(dá)水平高；bmp1在6，7 d的菌絲中表達(dá)水平較高，但在菌核和分生孢子中的表達(dá)水平相對(duì)較低；bmp3的表達(dá)規(guī)律與BcKMO基因基本一致，在7 d的菌絲和菌核中表達(dá)水平高(圖2)。

2.2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)BcKMO、bmp1和bmp3表達(dá)的影響 利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的野生型菌株BC22中BcKMO和MAPK途徑關(guān)鍵基因bmp1、bmp3的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcKMO和bmp1、bmp3均在含蔗糖和果糖的培養(yǎng)條件下表達(dá)水平較高，BcKMO和bmp1的表達(dá)情況基本一致，均是在含果糖的培養(yǎng)條件下表達(dá)水平最高(圖3)。

2.3 BcKMO基因突變體中bmp1和bmp3的表達(dá)分析

利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型BC22、突變體BCG183和BCG183/BcKMO中bmp1和bmp3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體BCG183中bmp1、bmp3的表達(dá)均發(fā)生了顯著的變化，bmp1的表達(dá)水平顯著高于野生型和回復(fù)突變體，而bmp3的表達(dá)水平顯著低于野生型和回復(fù)突變體(圖4)。

圖2 BcKMO、bmp1和bmp3的表達(dá)規(guī)律分析Fig. 2 Expression levels of BcKMO，bmp1，and bmp3

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)BcKMO、bmp1和bmp3表達(dá)的影響Fig. 3 Expression levels of BcKMO，bmp1，and bmp3 in different cultural conditions

圖4 突變體BCG183和BCG183/BcKMO中bmp1和bmp3的表達(dá)水平分析Fig. 4 Expression levels of bmp1 and bmp3 in mutants BCG183 and BCG183/BcKMO

2.4 bmp1和bmp3基因的RNAi突變中BcKMO的表達(dá)分析

利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)bmp1和bmp3基因RNAi突變體中BcKMO的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bmp1基因的RNAi突變體中BcKMO的表達(dá)水平顯著高于野生型，而bmp3基因的RNAi突變體中BcKMO的表達(dá)水平顯著低于野生型(圖5)。

圖5 bmp1和bmp3基因RNAi突變體中BcKMO基因表達(dá)分析Fig.5 Expression levels of BcKMO in RNAi mutants of bmp1 and bmp3

3 討論與結(jié)論

有文獻(xiàn)報(bào)道，灰葡萄孢M(jìn)APK信號(hào)途徑在病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19-20]。如bmp1基因影響附著胞的形成和穿透寄主組織的能力[8]，bmp3基因影響病菌的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢能力和產(chǎn)菌核能力[9-10]，BcSak1基因影響病菌的菌絲的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢能力和致病力[11]，編碼MAPK激酶(MAPKK)Ste7、MAPKK激酶(MAPKKK)Ste11和假定MAPK銜接蛋白Ste50的基因影響病菌的致病力、分生孢子的萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和菌核的形成等方面[14]。

實(shí)驗(yàn)室前期明確了灰葡萄孢致病基因BcKMO正調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育，負(fù)調(diào)控病菌的致病力[9-10]，但是該基因是否通過(guò)病菌的MAPK信號(hào)途徑起作用以及BcKMO與病菌MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因之間的關(guān)系尚未明確。本研究對(duì)灰葡萄孢致病基因BcKMO與病菌MAPK信號(hào)途徑之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183對(duì)MAPK信號(hào)途徑特異性抑制劑U0126不敏感性，且BcKMO與MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因bmp1、bmp3在表達(dá)規(guī)律上存在一定的相似性，由此確定BcKMO基因可能通過(guò)病菌MAPK信號(hào)途徑起作用。檢測(cè)突變體BCG183中MAPK信號(hào)途徑關(guān)鍵基因bmp1、bmp3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)突變體BCG183中bmp1的表達(dá)被顯著上調(diào)、bmp3的表達(dá)被顯著下調(diào)，表明BcKMO基因負(fù)調(diào)控bmp1的表達(dá)、正調(diào)控bmp3的表達(dá)。利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)bmp1、bmp3基因的RNAi突變體中BcKMO的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BcKMO在bmp1基因的RNAi突變體中被顯著上調(diào)，在bmp3基因的RNAi突變體中被顯著下調(diào)，表明bmp1負(fù)調(diào)控BcKMO的表達(dá)，bmp3正調(diào)控BcKMO的表達(dá)。研究結(jié)果為闡明BcKMO基因調(diào)控病菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。