張 潔,許喜林*,鄒彥桐,翁文川

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640;2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東 廣州 510640)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是威脅食品安全的常見致病微生物,在熟肉制品中有較高檢出率。腸毒素是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要因子[1],金黃色葡萄球菌性食物中毒潛伏期短,多在食入可疑食品2～6 h發(fā)病。而且金黃色葡萄球菌的生長受環(huán)境因素的影響巨大[2],溫度和濕度等都會影響它在熟肉制品中的生長情況。廣式燒臘制品是一種在廣東地區(qū)非常受歡迎的熟肉制品,其中又以叉燒、燒鵝以及燒鴨為典型代表,而大部分售賣方式為零售[3],食品安全難以得到保證。數(shù)據(jù)顯不,2008-2011年間廣東省出售的熟肉制品中,年平均檢出率最高的食源性致病菌為金黃色葡萄球菌(S.aureus)(4.9%),其次為單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocyto genes)(0.9%),略高于沙門氏菌(Salmonella)(0.4%)[4]。目前,對于金黃色葡萄球菌已經(jīng)有廣泛深入研究,韓永斌等[5]研究紫甘薯花色苷色素抑制金黃色葡萄球菌作用的生長規(guī)律,黃瀟等[6]對魚糕中金黃色葡萄球菌生長模型的建立,曹慧等[7]對涼拌面中金黃色葡萄球菌生長模型的建立,王亭亭等[8]對饅頭中金黃色葡萄球菌生長模型的建立,但專門針對廣式燒臘制品中的金黃色葡萄球菌的研究尚屬空白。

本實驗通過模擬廣式燒臘制品儲藏的環(huán)境條件[9],研究不同外部條件(溫度、pH、防腐劑)對金黃色葡萄球菌生長繁殖的影響[10-11],并探究廣式燒臘制品的不同滅菌方式。將廣式燒臘制品制成液體培養(yǎng)基,可以更好地反映金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品生長的特性。通過測定金黃色葡萄球菌在叉燒、燒鵝、燒鴨、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基以及7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線,探究不同滅菌條件對于叉燒、燒鵝、燒鴨中不同菌量的金黃色葡萄球菌的滅菌效果,最終確定可靠的滅菌方法,為廣式燒臘制品的殺菌處理提供參考依據(jù)。食品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量是產(chǎn)生腸毒素的主要條件,通過控制其生長繁殖對保障食品的安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與樣品

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):華南理工大學(xué)微生物學(xué)實驗室-80℃保存于體積分?jǐn)?shù)為50%甘油中;叉燒:華南理工大學(xué)后勤市場;燒鵝、燒鴨:廣州市天河區(qū)粵墾路五山金燕農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏粉3.0 g/L,氯化鈉5.0 g/L,最終pH 7.4±0.2)、7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏粉3.0 g/L,氯化鈉75.0 g/L,最終pH 7.4±0.2);Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0g/L,牛肉膏粉5.0 g/L,酵母膏粉1.0 g/L,丙酮酸鈉10.0 g/L,甘氨酸12.0 g/L,氯化鋰5.0 g/L,瓊脂15.0 g/L,最終pH 7.0±0.2)、卵黃亞硫酸鉀增菌液(30%卵黃鹽水2.083 mL,1%亞硫酸鉀溶液0.417 mL,每支2.5 mL添加于47.5 mL Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中):廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

甘油:、氯化鈉、氯化鉀:上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;鹽酸:廣州化學(xué)試劑廠;甲醛:廣州東紅化工廠;氫氧化鈉:南京化學(xué)試劑有限公司。所有實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MP502B型電子天平、JA2003型電子分析天平、752紫外可見分光光度計:上海精科儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺:蘇州華科凈化設(shè)備有限公司;GI36TW型全自動高壓滅菌鍋:致微(廈門)儀器有限公司;FX303-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海樹立儀器儀表有限公司;LHS-80型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:上海百典儀器設(shè)備有限公司;Dragon Med型手動單道可調(diào)式移液器:上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司;E4XLS型電動移液槍:美國瑞寧有限公司;FE20K Plus型pH計:梅特勒-托列多儀器(上海)有限公司;ES-1000W功率調(diào)節(jié)電爐:南海明輝五金電器廠。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌活化

取一環(huán)-80℃、體積分?jǐn)?shù)為50%甘油保存的新鮮金黃色葡萄球菌接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化(37℃恒溫培養(yǎng)24 h),通過梯度稀釋法得到濃度在103～104CFU/mL范圍內(nèi)的菌懸液,保存至冰箱待用。

1.3.2 廣式燒臘制品液體培養(yǎng)基的制作

分別稱量10.0g樣品,加入90.0 g蒸餾水,用高速組織搗碎機以20 000 r/min轉(zhuǎn)速進行搗碎[7],每次1 min,重復(fù)3次,撇去上層白色浮沫,均質(zhì)。取10.0 g搗碎液,加入90.0 g蒸餾水,121℃、20 min滅菌后即制得叉燒、燒鵝以及燒鴨液體培養(yǎng)基。

1.3.3 金黃色葡萄球菌在不同液體培養(yǎng)基中的生長

在無菌條件下,分別接種103～104CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液0.05 mL至1L瓶滅菌后的叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基以及7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,在37℃條件下恒溫培養(yǎng),每3 h取出一瓶液體培養(yǎng)基,利用紫外可見分光光度計測定波長560 nm處的吸光度值,繪制時間與OD560nm值曲線即可得到金黃色葡萄球菌生長曲線,以0 h時的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.4 不同pH值對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響

將滅菌后的液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)好pH后,在無菌條件下接種103～104CFU/mL金黃色葡萄球菌菌懸液0.05 mL至pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的廣式燒臘液體培養(yǎng)基中,分別在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h、在10℃條件下培養(yǎng)144 h后(金黃色葡萄球菌最適生長溫度是在37℃,故選擇短時間進行測量,而10℃是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生毒素的最低溫度,溫度低,選擇長時間進行培養(yǎng))測定其在波長560 nm處的吸光度值,以0 h時的培養(yǎng)基吸光度作為空白對照。

1.3.5 含鹽量對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響

在無菌條件下接種103～104CFU/mL金黃色葡萄球菌菌懸液0.05 mL至滅菌后的含鹽量為0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%、13.0%、15.0%的廣式燒臘液體培養(yǎng)基中,分別在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h,在10℃條件下培養(yǎng)144 h測定24 h后其在波長560 nm處的吸光度值,以0 h時培養(yǎng)基吸光度值作為空白對照。

1.3.6 不同滅菌方式對廣式燒臘制品中金黃色葡萄球菌的影響

將叉燒、燒鵝、燒鴨樣品切成0.5～1.0 g左右大小,稱取10.0 g置于培養(yǎng)皿中,接種使初始金黃色葡萄球菌量為105CFU/g、104CFU/g、103CFU/g,分別在不同的滅菌條件下對叉燒、燒鵝、燒鴨樣品進行滅菌,利用平板計數(shù)法測定滅菌后的樣品的金黃色葡萄球菌存活數(shù)量。滅菌條件盡可能模擬實際生活中對廣式燒臘的滅菌操作,包括微波滅菌、高壓滅菌、炒制滅菌。微波滅菌選用微波爐中高火檔位滅菌。高壓滅菌溫度115℃,與家庭使用高壓鍋可以達到的工作溫度接近。加熱滅菌選擇可調(diào)節(jié)式電爐,模擬家庭炒鍋加熱。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌在不同液體培養(yǎng)基中的生長

由圖1可知,營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的生長最為旺盛,叉燒、燒鴨、燒鵝培養(yǎng)基中其次,7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中則顯不出相對較低的生長水平。在前6 h,5種液體培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌生長緩慢,處于遲滯期,在6 h后,5種液體培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌菌數(shù)有著明顯的增長,進入對數(shù)期。18 h后,營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的OD560nm值增長放緩幾乎趨于穩(wěn)定;18～20 h叉燒、燒鴨、燒鵝液體培養(yǎng)基OD560nm值增長放緩,在20 h后OD560nm值趨于穩(wěn)定;7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在20 h后OD560nm值也趨于穩(wěn)定。

圖1 金黃色葡萄球菌在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Staphylococcus aureus in different media

2.2 pH值對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響

圖2 37℃條件下pH值對金黃色葡萄球在廣式燒臘制品中生長的影響Fig.2 Effect of pH value on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 37℃

由圖2可知,在37℃條件下,叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌在pH為5.0～8.0的范圍內(nèi)生長較好。在pH＜2.0時,金黃色葡萄球菌生長不明顯;金黃色葡萄球菌在pH 8.0～9.0之間時,生長急劇下降;pH＞9.0之后,金黃色葡萄球菌生長減緩。

表1 10℃條件下pH值對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響Table1 Effect of pH value on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 10℃

由表1可知,在低溫(10℃)條件下,金黃色葡萄菌在叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基pH為5.0～9.0范圍內(nèi)生長,比37℃條件下pH的生長范圍有所減小,這一結(jié)果與趙學(xué)廣等[12]的結(jié)果類似。

由圖2及表1可知,金黃色葡萄球菌在37℃條件下pH的生長范圍＞低溫(10℃)條件下pH的生長范圍,可以通過降低溫度的同時降低pH或提高pH抑制金黃色葡萄球菌的生長,但是太高或者太低的pH對風(fēng)味有較大影響。

2.3 含鹽量對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響

圖3 37℃條件下含鹽量對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響Fig.3 Effect of salt content on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 37℃

由圖3可知,37℃條件下叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌在含鹽量為0.5%～15.0%時均可生長,說明適宜溫度下金黃色葡萄球菌是可以耐高鹽的,有數(shù)據(jù)顯不金黃色葡萄球菌有很好的耐鹽性,可以在含鹽量為10%～15%的培養(yǎng)基中生長[13]。李文杰等[14]的研究結(jié)果顯不37℃的培養(yǎng)條件下在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,當(dāng)含鹽量達到17%時,培養(yǎng)24 h后金黃色葡萄球菌全部死亡。但是,叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的菌數(shù)均隨著含鹽量升高而呈現(xiàn)減弱的趨勢,其中含鹽量為8.0%時,金黃色葡萄球菌的生長有著明顯的減弱。

表2 10℃條件下含鹽量對金黃色葡萄球菌在廣式燒臘制品中生長的影響Table2 Effect of salt content on the growth of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue at 10℃

由表2可知,10℃時叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌僅在含鹽量為0.5%～5.0%時能夠檢測到生長,因此在低溫下其耐鹽度有所降低。趙學(xué)廣等[12]的研究結(jié)果顯不,在TBS培養(yǎng)基中,溫度為10℃時,金黃色葡萄球菌在鹽濃度為6.5%以下生長。本研究中廣式燒臘液體培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌對鹽的耐受度較低。

由圖3及表2可知,對比在37℃以及10℃條件下叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌對含鹽量的耐受度,可得出雖然金黃色葡萄球菌是耐鹽微生物,但在低溫下其耐鹽度有所降低,氯化鈉含量＞5.0%之后,對金黃色葡萄球菌在低溫下的生長有很好的抑制作用。由于要保證產(chǎn)品本身的風(fēng)味在含鹽量4.0%可接受范圍以內(nèi),在10℃條件下,無法通過提高含鹽量來完全阻止金黃色葡萄球菌的生長,但提高含鹽量可以一定程度抑制其生長。

2.4 不同滅菌方式對廣式燒臘制品中金黃色葡萄球菌的影響

廣式燒臘制品金黃色葡萄球菌的數(shù)量是腸毒素生成的重要條件,因此必須加以控制。根據(jù)廣式燒臘制品再加工的實際情況,選取了微波滅菌(微波功率700 W)、高壓滅菌(溫度115℃、壓力0.15 MPa)、炒制滅菌(溫度200℃)三種方式對廣式燒臘制品進行處理,不同初始菌量下產(chǎn)品滅菌后的存活菌數(shù)分別如表3、表4和表5所不。

表3 微波滅菌后廣式燒臘中的存活菌數(shù)Table3 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after microwave sterilization

表4 高壓滅菌后廣式燒臘中的存活菌數(shù)Table4 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after autoclaved sterilization

表5 炒制滅菌后廣式燒臘中的存活菌數(shù)Table5 Survival amounts of Staphylococcus aureus in Cantonese barbecue after stir-frying sterilization

由表3可知,同等初始菌量的條件下,滅菌時間越長,對金黃色葡萄球菌的滅菌效果越好。微波滅菌3 min,可以徹底殺滅初始菌量為104CFU/g和103CFU/g的金黃色葡萄球菌。由表4可知,115℃高壓滅菌15 min以上,可以徹底殺滅3種樣品中3個濃度的金黃色葡萄球菌。由表5可知,炒制滅菌6 min以上有較好的滅菌效果。

對比不同的滅菌方式,發(fā)現(xiàn)高壓滅菌效果最好,115℃、20 min可以徹底殺滅3種樣品中的3個濃度水平的金黃色葡萄球菌。微波滅菌(700 W)需3 min,炒制(加食用油炒制)滅菌需6min才能達到較好滅菌效果。分析這幾種滅菌方式,滅菌不徹底的原因可能是,熱量傳導(dǎo)需消耗一定時間,樣品內(nèi)部的溫度無法很快到達滅菌溫度,以至于有金黃色葡萄球菌存活。另外,對比3種不同的樣品,燒鵝的金黃色葡萄球菌存活率略高于燒鴨、叉燒。原因可能是,燒鵝以及燒鴨的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在滅菌處理過程中要使樣品的每一部分都均勻受熱可能需要更長的時間,故在同樣的時間下,叉燒的中金黃色葡萄球菌存活率低于其他兩者。汪玲玲等[15]研究了不同減菌方法對于金黃色葡萄球菌的減菌效果,60℃加熱5 min和18 W紫外照射15 min兩種處理對金黃色葡萄球菌的最大比生長速率影響顯著。

3 結(jié)論

通過對叉燒、燒鴨、燒鵝液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長曲線的測定,得到生長趨勢為前6 h生長緩慢,6～18 h增長迅速,18～20h生長開始穩(wěn)定,并對比發(fā)現(xiàn)7.5%鹽度對于金黃色葡萄球菌生長有一定的抑制作用,且抑制作用比起營養(yǎng)成分不足的影響要明顯。

通過研究37℃以及10℃條件下不同pH的叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌的影響,結(jié)果顯不在37℃條件下,金黃色葡萄球菌在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)生長;在10℃時,金黃色葡萄球菌在pH 5.0～9.0的范圍內(nèi)生長。叉燒、燒鵝、燒鴨本身產(chǎn)品的pH是非常適宜金黃色葡萄球菌生長的,適當(dāng)降低產(chǎn)品pH不能完全阻止但可抑制金黃色葡萄球的生長。

通過研究在37℃以及10℃條件下不同含鹽量的叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基對于金黃色葡萄球菌的影響。在37℃時,叉燒、燒鵝、燒鴨液體培養(yǎng)基在含鹽量≤15.0%時金黃色葡萄球菌均生長;在10℃條件下,含鹽量≤5.0%時生長。廣式燒臘制品的含鹽量值一般在4.0%以下,可以發(fā)現(xiàn)提高其含鹽量不能完全阻止但可抑制金黃色葡萄球的生長。

通過研究不同滅菌方式對于不同初始菌量的金黃色葡萄球菌在叉燒、燒鴨以及燒鵝中的滅菌情況,115℃高壓滅菌20 min可對叉燒、燒鵝、燒鴨三種樣品中金黃色葡萄球菌徹底滅菌。對于其他滅菌方法,推薦使用微波滅菌(700 W)3 min以上,蒸汽滅菌30 min以上,加熱滅菌6 min以上。

本研究針對的是廣式燒臘中金黃色葡萄球菌的生長與控制,與實際的微生物環(huán)境并不全然相同。從實際加工過程中對于廣式燒臘產(chǎn)品的滅菌操作出發(fā),探索徹底殺滅金黃色葡萄球菌的有效滅菌方法,可以為消費者提供指導(dǎo)性建議。故在后續(xù)的研究中,可以探究廣式燒臘制品中沙門氏菌、常見的霉菌與金黃色葡萄球菌共生時,金黃色葡萄球菌的生長情況[16]。