孫慶揚,趙 悅,楊雪峰,何霞紅*

(1.云南農業(yè)大學 農業(yè)生物多樣性應用技術國家工程研究中心,云南 昆明 650201;2.中糧華夏長城葡萄酒有限公司,河北 昌黎 066600)

蘋果酒是一種以鮮榨蘋果汁或濃縮蘋果汁為原料經發(fā)酵釀制而成的低度型飲料酒[1]。蘋果酒不僅較多地保留了蘋果中原有的大部分營養(yǎng)物質,同時還具有柔和的醇香和酯香,因而為國內外消費者所喜愛[2]。在全球范圍內,蘋果酒的年產量僅次于葡萄酒,是國際飲料酒市場的一大熱點果酒[3]。

在目前果酒的釀造過程中,二氧化硫幾乎是不可缺少的一種輔料,其在釀造過程主要起抑菌和抗氧化等重要作用[4]。由于蘋果汁富含酚類物質,其在多酚氧化酶的作用下極易發(fā)生褐變[5],因此在蘋果酒釀造過程中需要添加相對較多的二氧化硫來抑制多酚氧化酶的活性,從而達到防止果汁褐變的效果[6]。雖然蘋果汁的褐變可在發(fā)酵成蘋果酒的過程中得到一定的改善,但綜合考慮二氧化硫的抑菌和抗氧化效果,其添加量也要達到70～90 mg/L[7]。添加過多的二氧化硫一方面會影響發(fā)酵過程中酵母菌[8-9]和乳酸菌[10]的正常代謝;另一方面,攝入較多的二氧化硫還會對人的健康,特別是過敏人群,造成嚴重的影響[11]。因此,有研究者嘗試通過改進發(fā)酵條件和使用二氧化硫替代物[12-13]等實現(xiàn)一些果酒的“減硫法”[14-15]乃至“棄硫法”釀造[16-17]。但關于該方法在蘋果酒釀造過程中的應用及對蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質影響的研究很少涉及。

本研究以小國光蘋果為試驗材料,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法(headspace solid-phase microextraction-gaschromatography-massspectrometry,HS-SPME-GC-MS)測定“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中的揮發(fā)性香氣物質,探究“減硫法”釀造對蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質的影響,以期為蘋果酒釀造過程中二氧化硫的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果酒釀造所使用的原料為小國光,產地為河北省秦皇島市青龍縣,果汁平均含糖量為128 g/L;釀酒酵母X16、LAFAZYMREXTRACT果膠酶(使用量5～10 g/100):法國LAFFORT公司;焦亞硫酸鉀為WINY:意大利Enartis公司。

3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)(分析純)、4-甲基-2-戊醇(純度98%):美國Sigma Aldrich公司;氫氧化鈉(分析純):上海市四赫維化工有限公司;氯化鈉(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器與設備

Unico 7200型可見分光光度計:Unico(上海)儀器有限公司;SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS復合萃取頭(50/30 μm):美國Supelco公司;GC/7890B-MS/5977A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、DB-WAX毛細管柱:美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點:原料經過篩選,剔除殘次、霉爛、病蟲等不良果實,隨后進行破碎榨汁(*添加焦亞硫酸鉀,其中“減硫法”釀造添加量為100 mg/L;常規(guī)法釀造添加量為200 mg/L),果汁入罐(60 L)并添加果膠酶(20 mg/L)澄清,24 h后澄清汁接種酵母(200 mg/L,40℃活化30 min后添加),20℃控溫酒精發(fā)酵,待發(fā)酵結束(殘?zhí)橇康陀? g/L),需分析檢測的原酒置于密封容器中于-20℃貯存。

1.3.2 蘋果酒理化指標測定

蘋果酒中各項基本理化指標進行測定參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》,并稍作改進。酒精度采用密度瓶法測定;還原糖含量采用DNS比色法測定;總酸含量(以蘋果酸計)采用電位滴定法測定;揮發(fā)酸含量(以乙酸計)采用水蒸氣蒸餾-滴定法測定。

1.3.3 蘋果酒揮發(fā)性香氣物質測定

蘋果酒中揮發(fā)性香氣化合物采用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)測定。

樣品預處理:準確量取6.000 mL蘋果酒樣品于15 mL固相微萃取瓶中,加入1.50 g NaCl、質量濃度為2.00 g/L的4-甲基-2-戊醇(內標物)20μL和一枚磁子,立即用帶有聚四氟乙烯墊片的蓋子蓋緊,將樣品瓶置于固相微萃取平臺上,加熱溫度為45℃,預熱10 min。然后用固相微萃取頭在45℃加熱條件下萃取吸附50 min,待吸附平衡后迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口,推出纖維頭熱解吸10min,同時進行質譜分析。

氣相色譜條件:揮發(fā)性物質分離采用DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);升溫程序:初始溫度40℃保持2 min,隨后以3℃/min的速度升至85℃,保持2 min,再以3℃/min的速度升至120℃,并保持3min,再以3℃/min升至200℃,最后以5℃/min升至230℃,保持10 min。載氣為氦氣(He)(純度99.999%),流速:1.0 mL/min。不分流進樣。

質譜條件:采用電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量為70 eV,檢測器溫度250℃,離子源溫度為230℃,全掃描模式,掃描范圍:30～400 m/z,無溶劑延遲。

1.3.4 揮發(fā)性化合物的定性定量分析

揮發(fā)性香氣物質采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析、鑒定,通過檢索美國國家標準與技術研究所(national institute of standards and technology,NIST)14質譜庫進行初步檢索和分析,同時結合保留指數(shù)和相關文獻進行譜圖人工解析,確定各個揮發(fā)性物質的化學成分,并對所鑒定出的揮發(fā)性香氣物質采用內標峰面積比值法進行定量,其計算公式如下:

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

每組樣品各指標進行三組平行測定,采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析(獨立樣本T檢驗,α=0.05,雙尾檢驗)。

2 結果與分析

2.1 “減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒基本理化指標分析

“減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒的各項基本理化指標如表1所不。由表1可知,與常規(guī)法釀造相比,“減硫法”釀造的蘋果酒中還原糖含量略高為1.94 g/L,相應的酒精度略低為7.40%vol,同時,“減硫法”釀造的蘋果酒干浸出物也略高為18.96 g/L。雖然兩種釀造方法的蘋果酒pH值差異不大(分別為3.60和3.63),但“減硫法”釀造的蘋果酒中總酸(4.92 g/L)和揮發(fā)酸(0.31 g/L)含量則稍高于常規(guī)法釀造(4.59 g/L和0.25 g/L)。

表1 “減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒的基本理化指標Table1 Basic physicochemical indexes of cider brewed by'sulfur reduction method'and normal method

2.2 “減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質分析

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法,對“減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質進行吸附、萃取、分離和分析,結果如表2所不。由表2可知,“減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒中共檢測到揮發(fā)性香氣物質66種,包括15種醇類、30種酯類、7種脂肪酸類、3種酮類、6種芳香族類、3種萜烯類、和2種其他類。

表2 “減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒中揮發(fā)性香氣物質GC-MS分析結果Table2 GC-MS analysis results of volatile aroma compounds in cider fermented by'sulfur reduction method'and normal method mg/L

續(xù)表

2.2.1醇類

高級醇是酵母酒精發(fā)酵的次生代謝物,其生成量受多種因素影響。高級醇的形成途徑主要有兩條,即生物合成途徑和Ehrlich途徑,其都是在發(fā)酵過程中,釀酒酵母通過相應α-酮酸的脫羧作用生成[18-19]。高級醇通常具有強烈的刺激性氣味,在較低的濃度時這類物質可以增加果酒香氣的復雜性;但在較高濃度下則會對果酒的香氣產生負面影響[20]。

“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中分別檢測到14種和15種高級醇類物質,且常規(guī)法釀造蘋果酒中多數(shù)高級醇類物質含量顯著高于“減硫法”釀造(P＜0.05)。在檢測到的15種醇類中,異戊醇在兩種方法所釀蘋果酒中含量均較高,其含量可達高級醇類物質總量的78%以上,為蘋果酒中最重要的高級醇類物質,且其在常規(guī)法釀造的蘋果酒中含量為44.08 mg/L,高出“減硫法”釀造蘋果酒約50%。雖然多數(shù)高級醇類物質在常規(guī)法釀造的蘋果酒中較高,但“減硫法”釀造的蘋果酒中具有柑橘和橙樣香氣的正庚醇(0.33mg/L)和正壬醇(0.54 mg/L)的含量則極顯著高于常規(guī)法釀造(P＜0.01)。而具有奶油樣香氣是2,3-丁二醇是果酒中為數(shù)不多能夠呈香的多元醇[2],其在“減硫法”釀造的蘋果酒中含量也高于常規(guī)法。除上述高級醇類物質外,兩種方法釀造的蘋果酒中還檢測到一種硫醇類物質,即3-甲硫基丙醇,該物質具有類似圓蔥的香氣,其在常規(guī)法釀造蘋果酒中要高于“減硫法”釀造。另外,在常規(guī)法釀造蘋果酒中還檢測到有少量的順-5-辛烯-1-醇。

2.2.2 酯類

果酒中的酯類香氣物質主要是具有花果類香氣的乙酸酯和脂肪酸乙酯,它們對果酒的香氣起著極其重要的作用,是果酒中果香最主要的來源[21]。

“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中共檢測到30種酯類物質,其中“減硫法”釀造蘋果酒中乙酸酯9種、乙基酯11種、其他酯9種;“減硫法”釀造蘋果酒中乙酸酯6種、乙基酯11種、其他酯7種。采用“減硫法”釀造的蘋果酒中乙酸酯類、乙基酯類和其他酯類物質總量均高于常規(guī)法釀造蘋果酒。

“減硫法”釀造的蘋果酒中具有愉快的果香的乙酸丁酯的含量(14.36 mg/L)是常規(guī)法釀造蘋果酒的2.6倍;而具有花香和果香的乙酸苯乙酯的含量(2.18 mg/L)常規(guī)法釀造蘋果酒是“減硫法”含量的近3倍。乙酸異戊酯具有香蕉的香氣,其含量可達乙酸酯總量的53%以上,且常規(guī)法釀造的蘋果酒中乙酸異戊酯的含量極顯著高于“減硫法”釀造的蘋果酒(P＜0.01),此外,該物質在兩種方法所釀蘋果酒中的含量與異戊醇的含量還具有明顯的相關性。乙酸乙酯和乙酸異丁酯都具有明顯的水果香氣,它們在兩種方法釀造的蘋果酒中的含量無明顯差異(P＞0.05)。另外,與常規(guī)法釀造的蘋果酒相比,“減硫法”釀造的蘋果酒中還含有少量的乙酸葉醇酯以及微量的乙酸異辛酯和3-甲硫基丙醇乙酸酯。

在“減硫法”釀造的蘋果酒中多數(shù)乙基酯,特別是在乙基酯總量中占有較大比例的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量均顯著高于常規(guī)法釀造的蘋果酒(P＜0.05),僅有2-甲基丁酸乙酯和反式-4-癸烯酸乙酯在常規(guī)法釀造的蘋果酒中含量稍高。另外,具有甜果香的丁酸乙酯和具有淡雅黃油香的乳酸乙酯則分別僅在常規(guī)法和“減硫法”釀造的蘋果酒中檢測到。

除上述各種乙酸酯和乙基酯外,兩種方法釀造的蘋果酒中還檢測到9種其他酯類物質。其中,辛酸甲酯(柑橘香)、癸酸甲酯(煙草香)和辛酸-3-甲基丁酯在“減硫法”釀造的蘋果酒中含量均高于常規(guī)法釀造的蘋果酒。此外,與常規(guī)法釀造相比,“減硫法”釀造蘋果酒中還額外檢測到兩種酯類物質,即己酸異戊酯和丁二酸二乙酯。

2.2.3 脂肪酸類

果酒中的揮發(fā)性脂肪酸類主要為果酒提供乳酪和脂肪類香氣,其主要來源于酒精發(fā)酵,并受發(fā)酵條件、發(fā)酵營養(yǎng)和所用酵母的影響[22]?！皽p硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中共檢測到的7種揮發(fā)性脂肪酸,其中丁酸、辛酸和9-癸烯酸在常規(guī)法釀造的蘋果酒中的含量均高于“減硫法”釀造的蘋果酒,而乙酸、己酸和癸酸在兩種方法釀造的蘋果酒中的含量并無明顯差異(P＞0.05)。另外,2-甲基丁酸也僅在“減硫法”釀造的蘋果酒中檢出。

2.2.4 酮類

除種類和含量均比較豐富的醇類、酯類和脂肪酸類物質外,“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中還檢測到3種酮類物質。其中,具有薄荷香的二異丁基酮在“減硫法”釀造蘋果酒中的含量極顯著高于常規(guī)法釀造蘋果酒(P＜0.01)。此外,“減硫法”釀造蘋果酒中還檢測到微量的4,4-二甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮。

2.2.5 芳香族類

以釀酒原料中的苯丙氨酸為底物,經轉氨和脫羧作用可形成多種芳香族類化合物[23]。其中,苯乙醇作為最重要的芳香醇對多種果酒的特征香氣具有重要影響[24-25]。

與常規(guī)釀造相比,雖然“減硫法”釀造的蘋果酒中該類香氣物質的種類較多,但在常規(guī)法釀造的蘋果酒中所檢測到的香氣物質的含量則均高于“減硫法”釀造,特別是具有蜂蜜和玫瑰花香的苯乙醇的含量為16.87 mg/L,極顯著高于“減硫法”釀造的6.00 mg/L(P＜0.01),同時其含量與乙酸苯乙酯含量也具有相關性。此外,采用兩種釀造方式的蘋果酒中還檢測到兩種揮發(fā)性酚類物質,分別為2-乙基苯酚和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。其中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有烘烤香和堅果香,對多種類型果酒的香氣均具有重要貢獻,該物質在“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果中含量分別為0.19 mg/L和0.24 mg/L。

2.2.6 萜烯類

萜烯類物質大多以糖苷結合態(tài)形似存在于釀酒原料,通常具有優(yōu)雅的花香和果香[26],但也有研究表明其可由微生物合成[27]。萜烯類物質的閾值通常相對較低,它們對果酒的花香和果香有著直接或協(xié)同的貢獻作用[28]。

“減硫法”和常規(guī)法釀造的蘋果酒中共檢測到3種萜烯類物質,且這類物質的種類和含量均在常規(guī)法釀造的蘋果酒中較多(高)。在“減硫法”釀造的蘋果酒中所檢測的萜烯類物質僅有β-大馬士酮(玫瑰花香),其含量為0.98 mg/L,極顯著低于常規(guī)法釀造的2.05mg/L(P＜0.01)。由于萜烯類物質結構不穩(wěn)定,其可受外界因素影響發(fā)生氧化、還原、聚合、環(huán)化以及分子重排等反應導致結構的改變,從而影響這類物質的檢測[28];此外,在不同的釀酒原料中,萜烯類物質的種類、含量以及與之結合的糖苷均有一定的差異[29],這些都是所釀果酒中萜烯類物質產生差異的原因。

2.2.7 其他類

“減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果中還檢測到2種其他類香氣物質,分別為甲氧基苯基肟和2,3-二氫苯并呋喃。其中,甲氧基苯基肟存在于多種植物[30]及發(fā)酵制品[31-32]中,由此推斷其可能來源于釀酒原料以及發(fā)酵過程。由表2可知,“減硫法”釀造的蘋果酒中甲氧基苯基肟含量為0.44mg/L顯著高于常規(guī)法釀造的0.19mg/L(P＜0.05)。另外,2,3-二氫苯并呋喃在兩種方法釀造的蘋果酒中均有檢出,并且具有相似的含量。

3 結論

本研究以小國光蘋果為試驗材料,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用法對“減硫法”和常規(guī)法釀造的小國光蘋果酒中的揮發(fā)性香氣物質進行測定和分析。結果表明:“減硫法”和常規(guī)法釀造蘋果酒中共檢測到揮發(fā)性香氣物質66種,包括15種醇類、30種酯類、7種脂肪酸類、3種酮類、6種芳香族類、3種萜烯類和2種其他類。與常規(guī)法釀造相比,“減硫法”釀造有助于提升蘋果酒中酯類物質,特別是具有豐富果香和花香的乙基酯類物質的含量,同時還能有效降低蘋果酒中的高級醇,特別是具有酒精味和溶劑味的異戊醇的含量。但“減硫法”釀造會降低蘋果酒中脂肪族類、芳香族類和萜烯類物質的含量,造成蘋果酒中乳酪香、烘烤香和部分花香的減弱。采用“減硫法”釀造對蘋果酒中各項基本指標略有影響,適當減少二氧化硫的使用量可在一定程度上改善蘋果酒的香氣品質。