劉小芳，陳谷，林詩琪，許白雪

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

隨著現(xiàn)代工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，大量的污水排放以及肥料重施，造成廢水中氮的含量劇增。近幾十年來，我國地表水和地下水中氮的濃度不斷增加，例如 1980年到 2010年，我國每年的氮沉積量增加60%[1,2]。氮過量影響生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和農(nóng)業(yè)效益，處理廢水成為重要的工作。微藻不但可以用于新型能源的開發(fā)，也可以應用于處理工農(nóng)業(yè)廢水[3]。微藻可以利用廢水中各種形式的氮源，如銨鹽或硝酸根；但是微藻的生長對銨鹽濃度較敏感，處理廢水過程中過高濃度的銨會抑制微藻的生長。研究微藻在銨鹽中的生長，探索微生物適應高濃度 NH4+/NH3的機制，將為未來提高微藻對銨鹽的耐受奠定基礎。研究擬南芥中EGY1突變導致的銨敏感突變株amso1對銨鹽脅迫的響應機制，揭示參與銨脅迫響應的基因中90%的基因調(diào)控都依賴于EGY1[4]。EGY1是擬南芥S2P蛋白酶編碼基因之一，故本研究探討集胞藻中的S2P蛋白酶基因sll0528是否參與集胞藻對銨鹽脅迫的響應。

集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）屬藍藻門色球藻目集胞藻屬，它通過二分裂方式增殖，培養(yǎng)周期短，既可光合自養(yǎng)、混養(yǎng)還可異養(yǎng)。類似綠色植物，集胞藻PCC6803有兩個光合作用系統(tǒng)，光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）。由于集胞藻PCC6803獨特的生理特征，以及測序完全等特點，已成為研究光合作用、脅迫響應等的模式生物，也作為工程菌應用于新型能源的開發(fā)[5,6]。S2P家族蛋白酶存在于從細菌到人類的多數(shù)物種，不同物種間的S2P蛋白酶都具有保守的催化基序[7]，S2P蛋白酶介導的調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解機制被認為是潛在的外界信號接收傳導機制。在大腸桿菌等原核細菌中，當機體受到刺激時，S1P和S2P蛋白酶連續(xù)剪切抗σ因子，釋放EFCσ因子，EFCσ因子結合RNA聚合酶中心酶，轉錄表達相應的蛋白以適應刺激[8]。集胞藻PCC6803中有四個S2P蛋白酶 Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821。通過敲除基因slr0643并研究該缺失藻株Δslr0643，發(fā)現(xiàn)Slr0643參與酸脅迫響應機制[9]?；騭ll0862的敲除導致缺失藻株Δsll0862在高溫和氧化脅迫響應中表現(xiàn)出缺陷，說明Sll0862參與調(diào)控高溫和氧化脅迫響應[10]。應用實時熒光定量PCR技術（RT-qPCR）研究集胞藻基因sll0528在不同脅迫下的表達譜，以及對sll0528敲除的缺失藻株Δsll0528進行各種脅迫響應實驗，都表明Sll0528參與多種脅迫包括鹽、滲透壓、高光等[11,12]。而敲除slr1821的缺失藻株Δslr1821在熱脅迫響應研究中揭示了 Slr1821對熱脅迫響應機制起著重要作用[13]。

本研究構建了集胞藻PCC6803基因sll0528在光誘導強啟動子-基因psbA2啟動子(PpsbA2)驅動下的過表達藻株 OE0528，并探究比較了不同氯化銨濃度條件下野生型（wild type，WT）、過表達藻株OE0528和缺失藻株Δsll0528的生理表型，初步揭示S2P蛋白酶Sll0528響應NH4+的功能與機理，為后續(xù)深入探索微藻對NH4+脅迫響應機制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：質(zhì)粒 pUC118，質(zhì)粒 pET-30b(+)，大腸桿菌DH10B，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA Ligase，Taq DNA聚合酶，Primer Star NDA聚合酶，硫酸卡那霉素，氯霉素，氨芐青霉素，BG11培養(yǎng)基（實驗室自配），HEPES，Na2S2SO3，三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES），質(zhì)粒小量提取試劑盒，細菌基因組DNA快速提取試劑盒，細菌/細胞RNA提取試劑盒，DNA純化回收試劑盒，反轉錄試劑盒，RT-qPCR試劑盒，氯化銨等。集胞藻PCC6803野生型，購自美國標準藻種庫。

主要儀器：PCR儀，核酸電泳儀，冷凍循環(huán)水浴鍋，干式恒溫器，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，臺式恒溫振蕩器，凝膠成像系統(tǒng)，高壓滅菌鍋，鼓風烘箱，多功能組合搖床，生物安全柜，紫外分光光度計，小型臺式離心機，臺式冷凍離心機，移液槍等。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構建與鑒定

圖1 重組質(zhì)粒p3031P0K構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction program for the recombinant plasmid p3031P0K

以集胞藻 PCC6803基因組 DNA為模板，通過PCR擴增得到slr2030和slr2031片斷，sll0528片段，和psbA2的啟動子片段，以pET-30b（+）為模板PCR擴增得到抗卡那霉素（kmr）片段，引物見表1，引物作用位置見圖2?；騾⒖夹蛄衼碜訬CBI數(shù)據(jù)庫。將獲得的目的基因片段純化回收后利用限制性內(nèi)切酶剪切，同時用同樣的限制性內(nèi)切酶剪切載體質(zhì)粒pUC118，再用連接酶將目的基因片段和載體質(zhì)粒按順序一一連接起來，構建重組質(zhì)粒 p3031P0K，重組質(zhì)粒p3031P0K構建方案如圖1所示。構建完成重組質(zhì)粒后通過PCR技術在DNA水平驗證目的基因片段是否插入質(zhì)粒。

1.2.2 同源重組質(zhì)粒轉化集胞藻PCC6803

采用 Williams[14]的方法將構建好的重組質(zhì)粒p3031P0K通過同源臂slr2030和slr2031同源轉化進入集胞藻PCC6803野生型。使過表達元件kmr+啟動子PpsbA2+sll0528插入到集胞藻基因slr2030和slr2031中間的中性位點，方案如圖2所示。得到轉化子后，將轉化子在含低濃度硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長，待長出單藻落，轉移到含低濃度硫酸卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按此方式逐步提高抗生素濃度并對過表達藻株傳代。期間不斷檢測DNA水平上的中性位點是否被替代，最終得到中性位點被替代的能穩(wěn)定遺傳的過表達藻株OE0528。進而進行基因sll0528表達水平的驗證。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.3 集胞藻PCC6803的培養(yǎng)方法

以OD730=0.1為起始濃度將集胞藻接入液體BG11培養(yǎng)基，在光照 25 μmol/(m2·s)，溫度 29 ℃，轉速 150 r/min搖床中連續(xù)培養(yǎng)5 d。液體BG11培養(yǎng)基中加入終濃度為0.02 M的HEPES。集胞藻藻落生長于固體BG11培養(yǎng)基中。固體BG11培養(yǎng)基加入濃度為0.02 M的HEPES，終濃度為0.3%的Na2S2SO3和終濃度為8 mM的TES。培養(yǎng)過程需加入相應抗生素。

1.2.4 過表達藻株OE0528在DNA水平的鑒定

用試劑盒提取WT和過表達藻株OE0528的基因組DNA，用表1所示過表達藻株驗證用引物進行PCR擴增，分別擴增中性位點基因序列，或者是插入中性位點的片段，看產(chǎn)物電泳圖條帶位置與理論值是否一致，來判斷過表達元件是否進入到集胞藻WT基因組相應位置。

1.2.5 過表達藻株OE0528在RNA水平的驗證

用試劑盒分別提取WT和過表達藻株OE0528的RNA，用DNase去除RNA中殘留的DNA，再將RNA反轉錄成單鏈cDNA，以cDNA為模板用RT-qPCR驗證用引物（表1所示）進行RT-qPCR擴增，來驗證sll0528是否得到過表達。采用相對定量法，以 rnpB基因作為內(nèi)參?；騬npB在集胞藻中負責編碼RNase P的亞基B，表達量恒定[15]。得到擴增曲線后統(tǒng)一閾值線得出CT值，將參照基因與目的基因CT值相減得?CT值，目的基因表達量=2?CT，得到野生型WT和過表達藻株OE0528中sll0528相對表達量，歸一化后進行比較。每個樣品做三個平行，每個平行4個重復。

1.2.6 集胞藻吸光度值和全細胞吸收值的測定

將WT和過表達藻株OE0528以OD730=0.1作為起始濃度接入液體BG11培養(yǎng)基中，控制脅迫條件，在光照 25 μmol/(m2·s)，溫度 29 ℃，轉速 150 r/min 搖床中連續(xù)培養(yǎng)5 d，每24 h取樣2 mL用紫外分光光度計測定730 nm處的吸光度值（A730/OD730）或進行全波長掃描，得到數(shù)據(jù)繪制曲線。每個樣品做3個平行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文采用Origin Pro 8.5，SPSS 19.0等軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)，得到集胞藻生長曲線圖和全細胞吸收圖，基因表達量柱狀圖等。實驗重復數(shù)均為 3次，n=3；圖中誤差線均表示實驗結果=均數(shù)±標準差（±SD）。顯著性檢驗采用單因素方差分析，與對照組做比較，“*”表示 p＜0.05 為顯著差異，“**”p＜0.01 為極顯著差異。

2 結果和討論

2.1 重組質(zhì)粒的構建與鑒定

圖2 重組質(zhì)粒p3031P0K同源轉化入集胞藻示意圖Fig.2 Schematic diagram of recombinant plasmid p3031P0K homologous transformed into Synechocystis sp. PCC6803

圖3 重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid

按圖1所示方案，構建好重組質(zhì)粒p3031P0K，質(zhì)粒插入基因slr2030片段、kmr，強啟動子PpsbA2，基因sll0528和基因slr2031片斷。重組質(zhì)粒構建完成后采用PCR鑒定目的基因是否插入質(zhì)粒，所用引物與構建時擴增5段目的基因用引物相同，見表1，引物作用位置圖2所示。以重組質(zhì)粒和WT基因組分別作模板，擴增基因slr2030片段、強啟動子PpsbA2、sll0528、基因slr2031片斷；再以重組質(zhì)粒和pET-30b（+）分別作模板，擴增 kmr。產(chǎn)物電泳并分析比較，結果顯示重組質(zhì)粒中各個片段PCR產(chǎn)物與以WT基因組、PET-30b（+）作模板各個片段PCR產(chǎn)物電泳后條帶位置一致（圖3）。測定PCR產(chǎn)物序列并比對，結果相同，說明5個目的片段成功插入到載體質(zhì)粒pUC118。

2.2 過表達藻株OE0528的構建與鑒定

2.2.1 DNA水平上鑒定

圖4 OE0528在DNA水平的鑒定Fig.4 Identification of the OE0528 at the DNA level

按圖2所示方案，將構建好的重組質(zhì)粒p3031P0K轉化導入集胞藻PCC6803野生型基因組，通過同源重組雙交換，借助同源臂slr2030和slr2031，將過表達元件 kmr+啟動子 PpsbA2+sll0528插入到野生型基因組的slr2030和slr2031基因中間，以期達到過表達基因sll0528的目的?；騭lr2030和slr2031中間位置可以用于插入外源基因[16]，作為中性位點，故選這兩段基因作為同源臂。待篩選到sll0528過表達藻株OE0528后，提取過表達藻株DNA，用引物3031-2-L，3031-2-R和3031-1-L，3031-1-R（表1）PCR擴增相應片段，引物作用位置見圖2，在DNA水平驗證sll0528的過表達。結果見圖 4。通過不斷提高培養(yǎng)基中卡那霉素（Km）的濃度，最終篩選出6株獨立的sll0528過表達藻株OE0528。分別以野生型和6株過表達藻株基因組為模板，用引物3031-2-L，3031-2-R和3031-1-L，3031-1-R進行PCR擴增。先以3031-2-L，3031-2-R為引物 PCR擴增，野生型擴增結果為 slr2030和slr2031部分片斷和基因間片斷，長度為1001 bp；當過表達藻株中 kmr+啟動子 PpsbA2+sll0528三個片段完全插入到中性位點時，擴增結果包括 kmr+啟動子PpsbA2+sll0528三個片段，長度為3350 bp；當過表達藻株中三個片段未完全取代中性位點片段時，擴增結果會出現(xiàn)3350 bp和1001 bp兩條條帶。如圖4A所示，野生型PCR擴增條帶在1001 bp附近，OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5 各過表達藻株PCR擴增條帶在3350 bp附近，長度與理論值一致，初步說明sll0528過表達元件已完全插入5株藻株中。但是過表達藻株 OE0528-6擴增結果顯示在3350 bp附近沒有條帶，說明過表達藻株OE0528-6中三個片段沒有插入到預期的中性位點，或者可能是引物3031-2-L和3031-2-R和OE0528-6基因組的結合位點發(fā)生變化導致引物無法正常結合而擴增。

為進一步驗證結果，以3031-1-L，3031-1-R為引物進行PCR擴增集胞藻slr2030和slr2031間中性位點被取代的部分，野生型結果為slr2030和slr2031中間部分，長度為610 bp；過表達藻株中，過表達元件三個片段完全取代中性位點slr2030和slr2031中間部分時，擴增結果應當為沒有任何條帶；三個片段不完全取代中性位點時，擴增結果會有條帶于610 bp處。結果如圖4B所示，野生型PCR擴增結果電泳后條帶在610 bp附近，6株過表達藻株擴增結果都沒有條帶于610 bp處。進一步說明過表達藻株中 kmr+啟動子PpsbA2+sll0528三個片段完全取代中性位點。這些結果說明 sll0528的過表達元件在藻株 OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5 中正確插入預定位置，但這些藻株中基因sll0528表達量是否高于WT仍需要進一步實驗證明。

2.2.2 RNA水平上鑒定

收集WT和6株過表達藻株OE0528培養(yǎng)至第4 d的藻液，提取RNA，設計引物sll0528-2-L，sll0528-2-R（表1），通過RT-qPCR實驗考察過表達藻株中基因sll0528是否過表達。得到目標基因和參照基因的 CT值，用?CT值法，算出目標基因的表達量，并計算相對于WT基因sll0528的表達量（圖5）。

圖5a RT-qPCR擴增曲線中各樣品兩個基因的擴增曲線相互聚集，圖5b RT-qPCR溶解曲線中兩個基因各自引物的峰值單一，都顯示出引物特異性好，實驗結果可靠。其中OE0528和WT中的rnpB基因擴增曲線基本重疊，說明rnpB在OE0528和WT表達量恒定，適合作為內(nèi)參。以WT中sll0528的表達量為1，過表達藻株 OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5，OE0528-6中基因sll0528相對表達量分別是12.48、19.93、19.22、25.31、17.37（圖5c），相對于WT，過表達藻株中sll0528表達量明顯提高。說明啟動子PpsbA2+sll0528基因片段在過表達藻株OE0528中成功插入并有效表達。6株過表達藻株中OE0528-4基因sll0528的相對表達量最高。

圖5 OE0528在RNA水平的鑒定Fig.5 Identification of the OE0528 at the RNA level

2.3 過表達藻株OE0528的生長曲線

圖6 OE0528的生長曲線Fig.6 Growth curve of the OE0528

為研究sll0528的過表達對集胞藻PCC6803的正常生長是否有影響，將 6株過表達藻株 OE0528和WT以起始濃度OD730=0.1開始，在正常條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d，并且每24 h取樣測定OD730值，測得OD730值繪制成生長曲線，如圖6所示。從圖中可以看出，6株過表達藻株OE0528生長曲線和WT生長曲線相近，各過表達藻株分別和WT對比進行顯著性分析，所有p＞0.05，無顯著性差異。其中OE0528-4生長速率稍慢，但sll0528在OE0528-4中表達量最高（圖5b），是否由于基因sll0528的高表達導致其生長速率降低，有待后續(xù)驗證。后續(xù)脅迫實驗采用過表達藻株OE0528-3，后續(xù)陳述中將其命名為OE0528。

2.4 缺失藻株?sll0528在氯化銨脅迫下的生長情況

圖7 ?sll0528在氯化銨脅迫下的生長曲線和全細胞吸收圖Fig.7 Growth curve and whole-cell absorption spectra of?sll0528 under ammonium chloride stress

考察 sll0528基因對集胞藻響應銨鹽脅迫的功能與作用，首先利用之前構建的敲除 sll0528缺失藻株?sll0528進行氯化銨脅迫實驗。?sll0528構建采用同源重組雙交換，用氯霉素抗性基因 cmr替換集胞藻PCC6803中的sll0528，達到完全敲除sll0528目的[12]。WT和?sll0528分別在終濃度0 mM、90 mM、105 mM、120 mM的氯化銨，正常溫度光照轉速條件下，連續(xù)培養(yǎng)5 d，繪制生長曲線（圖7a），并于第5 d測定全細胞吸收值（圖7c）。從圖7a中可以看出，WT在90 mM、105 mM濃度氯化銨下生長曲線和未加氯化銨下差異不大，WT生長并沒有受到太多影響，在120 mM濃度氯化銨條件下，WT生長速率稍微減弱。說明WT能適應低濃度氯化銨，在高濃度氯化銨下生長會稍微受影響。而?sll0528的生長速率隨著氯化銨濃度增加明顯變慢，在120 mM濃度氯化銨下生長速率為OD7300.02/d。說明?sll0528對銨鹽生長環(huán)境敏感，隨著氯化銨濃度增加生長趨勢明顯變緩。對比WT和缺失藻株?sll0528，缺失基因sll0528的?sll0528對銨鹽環(huán)境表現(xiàn)較為敏感，說明基因sll0528在適應銨鹽環(huán)境起著重要作用。

比較WT和缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)至第5 d的藻液顏色（圖7b），缺失藻株?sll0528接近透明無色，和WT相比幾乎沒有生長，說明基因 sll0528對集胞藻適應銨鹽脅迫必不可少。WT加氯化銨條件和未加氯化銨相比顏色略淺，表明120 mM氯化銨對WT生長有一定影響。

進一步觀察WT和?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)至第5 d的全細胞吸收圖（圖7c）。集胞藻PCC6803在全細胞吸收光譜中有三個特征峰，類胡蘿卜素：500 nm～550 nm，藻藍蛋白：600 nm～650 nm，葉綠素：680 nm，藻藍蛋白和葉綠素分別是藻膽體和光合系統(tǒng)的重要組成部分，藻膽體作為天線系統(tǒng)和光合系統(tǒng)相互作用推動光合作用的進行[17]，所以藻藍蛋白和葉綠素的含量與光合作用呈正相關。圖中可以看到，120 mM氯化銨下第5 d，WT的葉綠素和藻藍蛋白峰值高于缺失藻株?sll0528，提示 WT優(yōu)于缺失藻株?sll0528的光合系統(tǒng)功能，部分解釋了WT在120 mM氯化銨條件下能生長，而?sll0528幾乎不能生長。說明基因sll0528對集胞藻PCC6803適應銨鹽脅迫的重要作用，它的缺失導致缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下幾乎不生長。

同時WT在氯化銨條件下的葉綠素和藻藍蛋白峰值明顯低于其未加銨鹽條件下，和WT在120 mM氯化銨條件下生長速率慢于WT未加銨鹽的現(xiàn)象相符。

2.5 過表達藻株OE0528在氯化銨脅迫下的生長情況

圖8 OE0528在氯化銨脅迫下的生長曲線和全細胞吸收圖Fig.8 Growth curve and whole-cell absorption spectra of OE0528 under ammonium chloride stress

基因sll0528的敲除導致缺失藻株?sll0528對氯化銨比較敏感，就此探究過表達藻株 OE0528是否比WT更耐受高濃度氯化銨，故需比較過表達藻株OE0528和WT在高濃度氯化銨條件下的生長情況。首先對WT進行高濃度氯化銨培養(yǎng)，找出WT不能耐受的氯化銨濃度。六孔板實驗結果顯示，在高濃度氯化銨培養(yǎng)下WT生長受阻的現(xiàn)象隨銨鹽濃度上升而明顯加?。▓D8a），180 mM氯化銨對WT生長影響大，第3 d、第5 d OD730值僅為對照組未添加氯化銨的67%和 57%。故選用 180 mM 氯化銨來對比過表達藻株OE0528和WT的生長狀況。

如圖 8b所示，180 mM 氯化銨下，過表達藻株OE0528生長明顯優(yōu)于WT，第三天起與WT有顯著差異，第5 d時，OD730為WT的1.72倍。說明過表達藻株OE0528相對于WT更能耐受高濃度氯化銨，基因sll0528的過表達有利于過表達藻株OE0528適應銨鹽脅迫。

圖8c中，在180 mM氯化銨下培養(yǎng)至第5 d的藻液圖片顯示，WT顏色淺綠泛白，透徹清亮，而過表達藻株OE0528比WT顏色要深得多，顯示正常的深綠色，提示旺盛的生長。從第5 d的全細胞吸收圖（圖8d）看到，180 mM氯化銨下，WT的葉綠素和藻藍蛋白峰值明顯低于過表達藻株 OE0528，說明在 180 mM氯化銨條件下WT的光合系統(tǒng)嚴重損傷，光合作用受到較大影響，而OE0528的光合系統(tǒng)卻得到保護或進行了修復，損傷并不明顯，光合作用受到較小影響。這些結果說明，過表達藻株OE0528比WT更能適應高濃度的氯化銨脅迫，揭示基因sll0528在集胞藻PCC6803耐受高濃度銨鹽脅迫中起重要作用。

NH4+作為簡單的無機鹽形式是植物和藻類的優(yōu)選氮源，它被同化摻入碳骨架利用。低濃度的銨被銨/甲基銨轉運酶 Amt攝入，該酶的活性受氮狀態(tài)影響[18]，高濃度銨鹽影響生物正常生長。細菌中有兩種銨和碳骨架2-酮戊二酸結合的途徑：直接通過谷氨酸脫氫酶GDH或者先后通過谷胺酰胺合成酶GS和谷氨酸合成酶GOGAT的作用。但藍藻中GS-GOGAT循環(huán)是銨同化的主要途徑[19]。GDH缺失的集胞藻PCC6803缺失藻株在正常條件下銨的同化不受影響[20]。藍藻中存在兩種GS酶和兩種GOGAT酶[21]。有趣的是，集胞藻PCC6803中GS酶的作用會因過量銨的攝入而被弱化[22]，提示過量銨存在時，機體需要調(diào)低銨攝入或銨同化機制以保護正常生長。有研究表明微藻的生長在低生物量密度時對銨更為敏感[23]，說明銨鹽毒性可能與光合系統(tǒng)的捕光能力相關；研究氨對微藻的抑制作用，表明高氨引起高PH直接影響微藻的光合作用[24]；銨鹽對集胞藻的作用位點機制是銨鹽促發(fā)了PS II的放氧復合物（OEC）的光損傷；且銨鹽耐受力與位于PS II的psbA多基因家族成員相關[25,26]。

通過WT和sll0528缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)，觀察到WT生長稍微受影響，而?sll0528幾乎不生長，分析培養(yǎng)至第5 d的全細胞吸收圖，發(fā)現(xiàn)?sll0528的藻藍蛋白和葉綠素合成嚴重受損，表明缺失基因sll0528的?sll0528對銨鹽脅迫更敏感。而WT和過表達藻株OE0528在180 mM氯化銨條件下培養(yǎng)，觀察到WT生長受到較嚴重阻礙，生長速率是對照組未加氯化銨下的一半，OE0528的生長只是稍微受到影響，同樣地，分析培養(yǎng)至第5 d的全細胞吸收圖，發(fā)現(xiàn)180 mM氯化銨下OE0528比WT的藻藍蛋白和葉綠素峰值明顯更高，推測OE0528的色素合成途徑輕微受損或恢復得較好，說明過表達藻株OE0528比WT更耐受180 mM氯化銨。

Sll0528是集胞藻PCC6803四個S2P蛋白酶中響應脅迫種類最多、響應上調(diào)表達倍數(shù)最高的一個[12]，但是它對銨鹽脅迫響應的功能與機理是首次被研究。作為調(diào)節(jié)跨膜信號傳導的保守機制，S2P蛋白酶調(diào)控的膜內(nèi)蛋白水解機制可以在機體受到外界脅迫時，感知信號、傳遞信號并激活相應基因的表達，以維持機體適應外界環(huán)境。

上述對 sll0528缺失藻株?sll0528和過表達藻株OE0528在銨鹽脅迫下的研究顯示，Sll0528顯然參與了銨鹽脅迫的快速響應，可能介導了高銨鹽濃度下對光合系統(tǒng)的保護或修復機制。后續(xù)進一步的實驗將分析WT，OE0528，?sll0528在氯化銨脅迫下的轉錄組和代謝組，深入闡明 Sll0528如何通過膜內(nèi)蛋白水解機制調(diào)控集胞藻適應銨鹽脅迫。

3 結論

本文通過構建集胞藻PCC6803基因sll0528過表達藻株OE0528，和已經(jīng)構建的sll0528敲除的缺失藻株?sll0528，對比野生型，研究集胞藻PCC6803在氯化銨脅迫下的生長表型，發(fā)現(xiàn)?sll0528比WT對銨鹽脅迫更敏感，OE0528則比WT更耐受高濃度的銨鹽，表明Sll0528在集胞藻PCC6803適應銨鹽脅迫中發(fā)揮重要的作用，參與了銨鹽脅迫的快速響應，推測Sll0528直接或間接介導高銨鹽濃度下對光合系統(tǒng)的保護或修復機制。本研究初步揭示集胞藻中S2P蛋白酶 Sll0528對銨鹽脅迫的響應作用與機制，為未來揭示微藻對銨鹽的響應機制和提高微藻對銨鹽的耐受性和利用率奠定基礎。