陳 凡,林木貴,程亞麗,林梅西

(1． 福州大學材料科學與工程學院,福建 福州 350116； 2． 福建省閩中有機食品有限公司,福建 莆田 351100； 3． 閩南師范大學生物科學與技術(shù)學院,福建 漳州 363000)

0 引言

核受體超家族是一類配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,它在生物體內(nèi)廣泛分布,是多細胞生物體內(nèi)含量最豐富的幾大類轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一[1-3]. 核受體可以識別并結(jié)合特定的應答元件,最終實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控. 在體內(nèi),其活性可被相應的配體小分子調(diào)節(jié),進而參與調(diào)控細胞內(nèi)幾乎所有的生物學過程. 故核受體自身或受其調(diào)控基因的異常表達就成為了引發(fā)腫瘤在內(nèi)等多種疾病的重要因素之一[4-7].

為了快速評價核受體的功能并進行潛在配體的篩選,哺乳動物單雜交系統(tǒng)(也稱GAL4嵌合受體檢測)被成功構(gòu)建并取得快速發(fā)展,作為細胞層面的轉(zhuǎn)錄激活測定系統(tǒng),它已廣泛應用于核受體激動劑/拮抗劑的檢測與分析研究中[8-12]. 該技術(shù)將核受體的配體結(jié)合域(LBD)連接于酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域(DBD)之后,形成GAL4-NR-LBD融合蛋白表達序列. 再將融合蛋白表達質(zhì)粒與含有GAL4特異性響應元件的報告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細胞,最終通過對報告蛋白(多為熒光素酶)活性的測定,表征融合蛋白的激活程度. 為了排除無關(guān)因素的干擾,降低實驗誤差,常用的單雜交質(zhì)粒系統(tǒng)中往往還攜帶有組成型表達的報告蛋白序列作為內(nèi)參,減少細胞數(shù)量、細胞健康程度、轉(zhuǎn)染效率和非特異性細胞反應的影響,使主報告基因的結(jié)果歸一化 . 因此該技術(shù)具有速度快、成本低和實驗數(shù)據(jù)完全量化的特點,對結(jié)果的分析和比較極為有利.

但該系統(tǒng)在使用中并非全然無虞,傳統(tǒng)單雜交系統(tǒng)需要向供試細胞株轉(zhuǎn)染至少兩種質(zhì)粒(分別表達融合蛋白和報告蛋白). 一方面,質(zhì)粒的提取和保存過程容易因質(zhì)粒質(zhì)量差異(如斷裂和內(nèi)毒素殘留等)帶來實驗誤差. 另一方面,雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細胞時也可能存在轉(zhuǎn)染和表達效率差異,必須通過轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化予以彌補. 相比單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)系統(tǒng)無疑具有更多的不確定性,最終對實驗結(jié)果的重現(xiàn)性產(chǎn)生一定影響. 因此,本研究通過克隆pG5luc載體中的Gal4結(jié)合位點及下游螢火蟲熒光素酶基因,并將其插入pBind載體內(nèi),實現(xiàn)兩種質(zhì)粒的功能融合. 而后利用HEK 293T細胞,以RXRα等6種核受體為基礎對融合質(zhì)粒進行功能測試和評價.

1 材料與方法

1.1 菌種與細胞株

感受態(tài)細胞Trans5α(E.coliDH5α)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司,載體與片段酶切連接后按說明書所述步驟進行轉(zhuǎn)化. 人胚腎細胞HEK 293T購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,細胞培養(yǎng)使用添加10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行.

1.2 工具酶與試劑

FastPfu Fly DNA聚合酶,FlyCutBglII、BamHI、SalI、NotI限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶,均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司； pBind、pG5luc質(zhì)粒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司； TurboFect轉(zhuǎn)染試劑購于Thermo Fisher公司； UNIQ-500無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及4S Red Plus核酸染色劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司； DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均為HyCloneTM品牌. 引物合成和質(zhì)粒測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行. 核受體cDNA文庫、各類激動劑/拮抗劑由廈門大學藥學院張曉坤教授課題組饋贈.

1.3 單雜交質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建

通過如表1所示不同的引物組合(引物中的BamHI酶切位點以下劃線形式標出),將pG5luc載體(見圖1(a))中的GAL4結(jié)合序列(簡稱“G”)、螢火蟲熒光素酶基因(簡稱“F”)連同位于二者上下游的兩個調(diào)控序列(上游調(diào)控序列,簡稱“U”； 下游調(diào)控序列,簡稱“S”)分別擴增,形成不同長度的調(diào)控與功能序列組合,以BamHI酶切后連接至pBind載體(見圖1(b))中的BglII酶切位點處(BamHI與BglII為同尾酶). 為便于活性比較,轉(zhuǎn)化后僅篩選連接后正向引物靠近pBR3322位點而反向引物靠近CMV啟動子位點的轉(zhuǎn)化子做進一步測序及后續(xù)研究.

表1 質(zhì)粒改造使用的引物及序列表

圖1 載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic representation of vectors

1.4 融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI的檢索信息,設計引物從cDNA文庫中分別擴增RARα-LBD(E186-N416)、RXRα-LBD(T223-T462)、ERα-LBD(L310-H547)、GRα-LBD(T531-K777)、PPARγ-LBD(A237-L504)、Nur77-LBD(P361-F598)和LXRα-LBD(G167-V400)的DNA序列,經(jīng)SalI和NotI雙酶切后連接至載體的多克隆位點,經(jīng)測序確認無誤后予以保存以供后續(xù)轉(zhuǎn)染檢測.

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

為盡量減少細胞聚集生長對實驗結(jié)果的影響,研究使用48孔板作為報告基因?qū)嶒炤d體. 實驗前每孔接種量約為1.2×105個細胞,培養(yǎng)約24 h,待細胞融合度達到60%～70%后, 使用轉(zhuǎn)染試劑并按說明書要求進行轉(zhuǎn)染操作. 鑒于研究中各核受體LBD區(qū)長度差別不大,對構(gòu)建后質(zhì)粒的總長度影響較小,故確定雙質(zhì)粒單雜交體系轉(zhuǎn)染量為每孔80 ng[13](pBind-NR-LBD： 40 ng,pG5luc： 40 ng),單質(zhì)粒體系每孔轉(zhuǎn)染量為100 ng.

1.6 熒光素酶活性檢測

于細胞轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)液,并根據(jù)實驗需要添加核受體對應的激動劑(ATRA： 0.1 μmol·L-1,ROS： 10 μmol·L-1,T09： 1 μmol·L-1,PPT： 10 μmol·L-1,DEX： 1 μmol·L-1,CD3254： 0.1 μmol·L-1)及拮抗劑(UVI3003： 0.5 μmol·L-1)后繼續(xù)培養(yǎng)18 h,最終裂解細胞,并使用多功能酶標儀(TECAN Infinite?M200 Pro)及雙熒光素酶檢測試劑盒測定報告基因讀數(shù).

1.7 不同單雜交體系的變異系數(shù)(CV)比較

分別在同一天(重復6次操作)和連續(xù)6周(每周復蘇、培養(yǎng)細胞后檢測一次)進行雙質(zhì)粒和單質(zhì)粒系統(tǒng)下Nur77-LBD的活性檢測. 模擬多次實驗操作的結(jié)果,對每組每次實驗結(jié)果的CV值進行統(tǒng)計分析,比較兩種單雜交系統(tǒng)在實驗精密度和重現(xiàn)性上的區(qū)別.

1.8 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)使用Minitab v17.0軟件進行方差分析和多重比較. 各圖中無共享字符的兩組均表示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 功能融合質(zhì)粒的構(gòu)建與基本功能測試

分別使用pG5luc-U-F/pG5luc-S-R、pG5luc-U-F/pG5luc-F-R、pG5luc-G-F/pG5luc-S-R、pG5luc-G-F/pG5luc-F-R等4對引物組合對pG5luc載體序列進行擴增,通過酶切連接后獲得pBind-UGFS(8 667 bp,簡稱“UGFS”)、pBind-UGF(8 404 bp,簡稱“UGF”)、pBind-GFS(8 506 bp,簡稱“GFS”)及pBind-GF(8 243 bp,簡稱“GF”)等4種功能融合質(zhì)粒,隨后進行測序驗證. 在插入序列完全正確的情況下,將核受體RXRα的LBD表達序列克隆到質(zhì)粒的MCS位點,并對4種融合質(zhì)粒的熒光素酶本底信號進行初步評價,結(jié)果如圖2所示. 由圖2可知,與非融合質(zhì)粒組合(pBind-RXRα-LBD + pG5luc)相比,除GFS-RXRα-LBD外,其余3種質(zhì)粒本底值均較非融合質(zhì)粒組更低. GFS-RXRα-LBD由于不攜帶上游調(diào)控序列,因此難免受上游潛在啟動子序列的影響,出現(xiàn)熒光素酶活性“泄露”現(xiàn)象,帶來較高的本底數(shù)值.

基于RXRα-LBD的不同類型質(zhì)粒激活倍數(shù)(激活后的讀數(shù)/質(zhì)粒本底讀數(shù))檢測,結(jié)果如圖3所示. 由圖3中數(shù)據(jù)可知,UGFS-RXRα-LBD的激活效果與“pBind-RXRα-LBD + pG5luc”組合的效果最為接近(約為兩質(zhì)粒組合的80%),與“UGF”、“GFS”及“GF”3種質(zhì)粒的激活倍數(shù)存在顯著區(qū)別. 究其原因,“UGF”質(zhì)粒由于去除了下游調(diào)控序列,可能降低了熒光素酶mRNA的穩(wěn)定性,此情況下,即使該質(zhì)粒本底激活較低,也無法得到較高的激活倍數(shù). 對“GFS”質(zhì)粒而言,由于去除了上游調(diào)控序列,導致熒光素酶本底活性較高,故最終也無法觀察到理想的激活倍數(shù). 而“GF”質(zhì)粒雖然去除了全部的調(diào)控序列,表現(xiàn)出較低的本底值,但和“UGF”序列類似, 由于沒有下游調(diào)控序列的存在,導致其mRNA穩(wěn)定性較低,最終激活程度只能維持在較低水平. 當向檢測體系中同時添加激動劑和拮抗劑時,各質(zhì)粒系統(tǒng)下的熒光素酶活性均顯著降低,其下調(diào)程度約為60%～80%. 總體而言,質(zhì)粒系統(tǒng)激活倍數(shù)越低,則對拮抗劑的影響越為敏感.

綜合分析圖2、3的結(jié)果,可以認為UGFS系統(tǒng)是傳統(tǒng)雙質(zhì)粒系統(tǒng)較好的替代者,其針對激動劑和拮抗劑的響應與雙質(zhì)粒系統(tǒng)最為接近. 故課題組選用UGFS系統(tǒng)作為后續(xù)研究的基礎.

圖2 不同類型質(zhì)粒的本底熒光素酶活性比較(n=4)Fig.2 Basal luciferase activity of different plasmid systems (n=4)

圖3 基于RXRα-LBD的不同類型質(zhì)粒熒光素酶活性比較(n=4)Fig.3 Comparison of luciferase activity induced by different plasmid systems based on RXRα-LBD (n=4)

2.2 不同核受體在UGFS系統(tǒng)下的激活效果

為驗證UGFS質(zhì)粒是否適用于RXRα以外其它核受體的單雜交檢測,課題組進一步構(gòu)建了UGFS-ERα-LBD、UGFS-GRα-LBD、UGFS-RARα-LBD、UGFS-PPARγ-LBD和UGFS-LXRα-LBD等攜帶5種不同核受體LBD序列的質(zhì)粒,與UGFS-RXRα-LBD一同進行了轉(zhuǎn)染及相關(guān)檢測,檢測結(jié)果如圖4所示. 根據(jù)核受體的類型不同, 6種LBD的激活倍數(shù)在8～36之間,Z因子均大于0.6,已經(jīng)能夠滿足常規(guī)檢測的需要,可以用于篩選特定核受體的激動劑或拮抗劑.

2.3 UGFS系統(tǒng)實驗精密度測試

在細胞轉(zhuǎn)染時,單獨轉(zhuǎn)染一種質(zhì)粒理論上比同時轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒更容易得到精確而穩(wěn)定的結(jié)果. 為了驗證單獨轉(zhuǎn)染UGFS質(zhì)粒是否在實驗精密度和重復性上優(yōu)于傳統(tǒng)“pBind + pG5luc”體系,課題組構(gòu)建了pBind-Nur77-LBD與UGFS-Nur77-LBD質(zhì)粒. 由于Nur77-LBD具有自激活的特性,可以在不加入任何配體的情況下自行發(fā)揮活性[13],故其活性的產(chǎn)生僅與細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率有關(guān),排除了配體濃度的影響,適合進行實驗精密度測試,這一環(huán)節(jié)的實驗結(jié)果如圖5所示. 相對傳統(tǒng)體系而言,UGFS系統(tǒng)由于減少了所需轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒種類,更能夠取得精確且重復性強的數(shù)據(jù). 此外,不論何種重復方式,UGFS質(zhì)粒的CV值均保持在低而穩(wěn)定的水平,和雙質(zhì)粒體系相比,單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠明顯提高實驗精度,有助于獲得更為可靠的實驗數(shù)據(jù).

圖4 UGFS系統(tǒng)下不同核受體的激活效果比較(n=4)Fig.4 Comparison of activation effect between different nuclear receptors under UGFS system (n=4)

圖5 不同質(zhì)粒體系在實驗中的精密度比較(n=6)Fig.5 CV comparison of different plasmid systems (n=6)

3 討論

哺乳動物單雜交技術(shù)是核受體激動劑/拮抗劑篩選的重要手段,由于利用了存在于酵母菌內(nèi),而非哺乳動物細胞內(nèi)的GAL4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控體系,充分保證了作為報告蛋白的熒光素酶分子只能在外源嵌合受體的作用下得到表達,有效排除了細胞內(nèi)源受體或其它相關(guān)物質(zhì)的干擾,因此具有較高的信噪比和理想的實驗重現(xiàn)性.

本研究在pBind載體的基礎上通過融入pG5luc載體的部分序列建立了pBind-UGFS哺乳動物單雜交質(zhì)粒系統(tǒng),使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞后,經(jīng)檢驗所得數(shù)據(jù)與雙質(zhì)粒系統(tǒng)較為接近,其激活效率可達雙質(zhì)粒系統(tǒng)的80%以上(不同核受體種類略有區(qū)別),且經(jīng)鑒定單質(zhì)粒系統(tǒng)的實驗數(shù)據(jù)重現(xiàn)性明顯優(yōu)于雙質(zhì)粒系統(tǒng). 但值得注意的是：

1) 本研究所建立的UGFS質(zhì)粒系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染量為100 ng/孔(48孔板)時,轉(zhuǎn)染量及信號強度達最佳平衡,再行提高轉(zhuǎn)染量并不能顯著提高數(shù)據(jù)質(zhì)量,且可能因為轉(zhuǎn)染試劑的細胞毒性影響最終結(jié)果的穩(wěn)定[14]. 因此,若實際操作中采用相同條件,則可直接參考本研究的結(jié)果； 若實驗條件不同,由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染受轉(zhuǎn)染試劑、細胞種類及培養(yǎng)條件(培養(yǎng)液種類、細胞數(shù)量、培養(yǎng)時間等)的影響較大,則建議重新摸索最佳轉(zhuǎn)染量,以求獲得更為穩(wěn)定可靠的結(jié)論.

2) 本研究所用的pBind載體自身長度為6 360 bp,添加UGFS序列后,質(zhì)粒全長8 657 bp,若再將其它核受體的LBD區(qū)插入該載體,則質(zhì)粒全長可上升至9 500 bp左右,其轉(zhuǎn)染效率可能顯著降低[15-16]. 實際實驗過程中,pBind-UGFS質(zhì)粒雖然能夠保證核受體LBD與熒光素酶基因達到最佳的“1/1”比例轉(zhuǎn)染[17],但仍可能因為轉(zhuǎn)染效率的下降,導致整體檢測靈敏度降低,最終影響所得結(jié)果. 因此,針對pBind-UGFS質(zhì)粒骨架的進一步優(yōu)化,去除檢測的非必需序列仍是亟待解決的問題. 此外,隨著近年來新的熒光素酶蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)[18-21],將螢火蟲熒光素酶或pBind載體中的海腎熒光素酶(參比基因)替換為序列更短、化學發(fā)光活性更高的熒光素酶系統(tǒng),也是有效減少質(zhì)粒大小、提高轉(zhuǎn)染效率和檢測靈敏度的有效手段,值得進一步深入研究.

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