李 姣， 朱曉換， 古 蕾， 王亞男

（四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610101）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上僅次于大米、小麥和玉米的第4大糧食作物.馬鈴薯易受病毒感染，馬鈴薯病毒嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì).其中馬鈴薯卷葉病毒是最具破壞性的馬鈴薯病毒，普遍分布在世界（包括中國(guó)）大多數(shù)馬鈴薯種植地區(qū)［1］.馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）是黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus）的代表成員，通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播.PLRV侵染馬鈴薯植株，引起卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網(wǎng)狀壞死等癥狀，導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)，重者減產(chǎn)80%以上.

大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯生產(chǎn)是控制馬鈴薯病毒病的主要方法，然而優(yōu)良無(wú)病毒種薯的生產(chǎn)要求建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的可應(yīng)用于大規(guī)模樣本的病毒檢測(cè)技術(shù).目前馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）2種.ELISA因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測(cè)，然而，靈敏度較低和假陰性結(jié)果的干擾等缺點(diǎn)大大限制了其檢測(cè)的準(zhǔn)確性［2］.RT-PCR比ELISA更敏感，也常用于馬鈴薯病毒檢測(cè)［3-5］.然而，RT-PCR檢測(cè)過(guò)程需要4個(gè)步驟，先后分別是：1）從植物組織中提取RNA；2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）；3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）；4）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳成像可視化其反應(yīng)產(chǎn)物.因此，RTPCR的過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)，使其不能滿足對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行快速病毒檢測(cè)的要求.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）［6-11］是一種用具有鏈置換活性的 Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，通過(guò)2對(duì)（或3對(duì)）引物于65℃（Bst DNA聚合酶的最適溫度）恒溫條件下擴(kuò)增的技術(shù).其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂［6-8］.RT-LAMP反應(yīng)只需1個(gè)恒溫水浴鍋，在1 h內(nèi)完成，因此是一種簡(jiǎn)單、快速和成本低的馬鈴薯病毒檢測(cè)方法.然而，在RT-LAMP檢測(cè)中，制備RNA模板不僅是檢測(cè)的第一個(gè)步驟，也是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)［8］.目前主要使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法等方法從待測(cè)植物樣品中提取總RNA作為RT-LAMP擴(kuò)增的模板，這些方法操作復(fù)雜，提取時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)提取液中含有的苯酚、氯仿等試劑易對(duì)環(huán)境造成污染.在對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)的過(guò)程中，RNA模板的提取已成為檢測(cè)過(guò)程中耗時(shí)耗力最多的一個(gè)環(huán)節(jié).本研究將無(wú)菌大頭針的針尖刺感染馬鈴薯卷葉病毒的馬鈴薯植株的莖尖，用粘附在針尖處的微量植物組織汁液直接進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，此RNA是RT-LAMP擴(kuò)增用的模板.其擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)肉眼觀察便可檢測(cè)出該植株有無(wú)感染PLRV，從而建立一種無(wú)需RNA模板制備，無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色，快速檢測(cè)PLRV的方法.該方法大大減少了檢測(cè)時(shí)間和成本，且操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用于對(duì)大規(guī)模樣本的病毒檢測(cè)，在大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯生產(chǎn)中有很大的應(yīng)用空間.本研究之所以采用馬鈴薯莖尖提取微量組織汁液，原因有2點(diǎn)：1）高細(xì)胞密度的莖尖可以使足夠量的組織汁液粘附在針尖處；2）植物細(xì)胞含有干擾 RTLAMP和RT-PCR反應(yīng)的抑制劑，而莖尖細(xì)胞含有的抑制劑較少，能減少對(duì)RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)的干擾.

1 材料與方法

1.1 供試植株 實(shí)驗(yàn)所用植株為培養(yǎng)室中生長(zhǎng)的馬鈴薯組培苗，其品種為“紫花白”.待測(cè)樣品包括經(jīng)ELISA法鑒定已感染PLRV的6份樣品和沒(méi)有感染PLRV的6份樣品.陽(yáng)性對(duì)照：已感染PLRV的馬鈴薯組培苗；陰性對(duì)照1：沒(méi)有感染PLRV的馬鈴薯組培苗；陰性對(duì)照2：以ddH2O為模板的RTPCR或RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 植物組織總RNA提取試劑盒（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）；5X TRUE RT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、Moloney Murine Leukemia Virus（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Promega公司）、2X Utaq PCR MasterMix試劑盒（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）；Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶（美國(guó) New England Biolabs公司）、10X ThermoPol反應(yīng)緩沖液（美國(guó) New England Biolabs公司）、RNase抑制劑（美國(guó)Promega公司）、甜菜堿（美國(guó)Sigma公司）；瓊脂糖和Goldview核酸染料（均購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司）、DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和6X上樣緩沖液（均購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司）.

1.3 引物 本研究中檢測(cè)的PLRV的基因?yàn)镻LRV外殼蛋白的編碼序列（ORF3），共627個(gè)堿基對(duì)（bp）.RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)所用的引物及引物序列和當(dāng)有PLRV感染植株時(shí)擴(kuò)增的目的片段如表1所示.所有引物均由成都擎科生物技術(shù)公司提供.表1中RT-PCR反應(yīng)所用的引物為正向引物F和反向引物B，當(dāng)有PLRV感染植株時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為一條長(zhǎng)627 bp的條帶.RT-LAMP反應(yīng)所用的引物為1對(duì)外引物（F3／B3）和1 對(duì)內(nèi)引物（FIP／BIP），當(dāng)有PLRV 感染植株時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為瀑布狀的DNA片段.

表1 RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)中所用引物的序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-PCR and RT-LAMP

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Bio-Rad PCR儀 C1000（美國(guó)Bio-Rad公司）；Bio-Rad水平15×10 cm Sub-Cell GT電泳槽1704481（美國(guó)Bio-Rad公司）；Bio-Rad Powerpac Basic基礎(chǔ)電源1645050（美國(guó)Bio-Rad公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) SYSTEM GelDoc XR+（美國(guó)Bio-Rad公司）；HH-6恒溫水浴鍋（常州朗博儀器制造有限公司）.

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 植物組織總RNA提取 按照傳統(tǒng)的RNA模板的制備方法，將剪下的莖尖組織（長(zhǎng)約0.1 cm）放入事先盛有液氮的研缽中，充分研磨，然后按照北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供的植物組織總RNA提取的說(shuō)明書(shū)，用該公司提供的植物組織總RNA提取試劑盒進(jìn)行操作.

1.5.2 微量組織汁液采集 如圖1所示，使用無(wú)菌大頭針的針尖刺馬鈴薯組培苗（苗高6～8 cm）莖尖，莖尖汁液隨之粘附在針尖處.在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，先將針尖浸在逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)液中，通過(guò)隨機(jī)引物，總RNA（PLRV和馬鈴薯的RNA）被逆轉(zhuǎn)錄為總 cDNA，然后轉(zhuǎn)移適量 RT反應(yīng)液（總量為0.5μg DNA）到PCR反應(yīng)液中，通過(guò)1對(duì)引物（表1中F／R），病毒DNA被擴(kuò)增為長(zhǎng)627 bp的片段.在RT-LAMP實(shí)驗(yàn)中，將針尖浸在反應(yīng)液中，由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反應(yīng)液中先被M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶通過(guò)2對(duì)引物（表1中 F3／B3和 FIP／BIP）擴(kuò)增.其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂［6-8］.如有白色沉淀，即可判定為帶PLRV植株；如沒(méi)有白色沉淀的出現(xiàn)，即可判定為無(wú)病毒植株.

圖1 微量組織汁液采集示意圖Fig.1 Illustration of collecting micro-tissue juice

1.5.3 RT-PCR RT-PCR 反應(yīng)首先對(duì)傳統(tǒng)法提取的RNA模板或者微量組織汁液中含有的RNA進(jìn)行RT反應(yīng)，然后對(duì)RT反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

傳統(tǒng)的RT反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中各成分含量為：1μg RNA和4μL 5X TRUE RT Master-Mix（該試劑包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和一對(duì)隨機(jī)引物）.各成分配置完成后，以雙蒸水補(bǔ)齊至20μL，于42℃恒溫反應(yīng)20 min，獲得DNA模板，隨后于85℃放置5 s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng).

微量組織汁液直接RT反應(yīng)體系總體積為20μL，成分同傳統(tǒng)的 RT反應(yīng)體系，只是不加RNA，以雙蒸水補(bǔ)齊至20μL.將粘附了莖尖汁液的針尖浸在RT反應(yīng)體系中，室溫中反應(yīng)15 min，獲得DNA模板，隨后于85℃放置5 s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng).操作中，盡量使粘附了莖尖汁液的針尖完全浸在RT反應(yīng)體系中，并蓋嚴(yán)管蓋，否則會(huì)影響RT反應(yīng)結(jié)果.

PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中各成分含量為：12.5 μL 2X Utaq PCR MasterMix、10 μM 正反向引物各1μL、0.5μg DNA模板.各成分配置完成后，以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL，放入Bio-Rad PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件包括：1）預(yù)變性：94 ℃，3 min；2）30 個(gè)循環(huán)：94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s；3）末次延伸：72 ℃，7 min.其反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè).

1.5.4 RT-LAMP 傳統(tǒng)的RT-LAMP反應(yīng)體系總體積為25μL，其中各成分含量為：1.6μM內(nèi)引物 FIP／BIP、0.4 μM外引物 F3／B3、2.5 μL 10X ThermoPol緩沖液、0.8 M betaine、1.0 mM dNTP、8 mM MgSO4、10 U M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、4 U RNase抑制劑、10 U Bst DNA聚合酶和0.1μg DNA模板.各成分配置完成后，以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL，于65℃恒溫反應(yīng)60 min，隨后放置于80℃ 5 min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng).

微量組織汁液直接RT-LAMP反應(yīng)體系總體積為25μL，其中各成分含量同傳統(tǒng)的RT-LAMP反應(yīng)體系，只是不加DNA模板，以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL.將粘附了莖尖組織汁液的針尖浸在RTLAMP反應(yīng)體系中，于65℃恒溫反應(yīng)60 min，隨后于85℃放置5 s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng).操作中，盡量使粘附了莖尖組織汁液的針尖完全浸在RT-LAMP反應(yīng)體系中，并蓋嚴(yán)管蓋，否則會(huì)影響RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果.

1.5.5 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像 將0.45 g的瓊脂糖放入30 mL 1X TAE緩沖液中溶解，滴入1.5μL Goldview核酸染料（比例：5μL核酸染料／100 mL 1X TAE緩沖液），倒入膠模中，室溫靜置約30 min，使膠完全凝固.把膠放入裝有適量1X TAE緩沖液的Bio-Rad凝膠電泳儀的電泳槽內(nèi)，分別往孔道中加入6μL DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和6μL RT-PCR或RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的混合液（比例：1μL反應(yīng)產(chǎn)物／5μL 6X上樣緩沖液）后，蓋上電泳槽，通電1～5 V／cm，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng).電泳完畢后，取出凝膠，在Bio-Rad成像系統(tǒng)中檢查凝膠并拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法的建立 大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯，能大大減少馬鈴薯卷葉病毒對(duì)生產(chǎn)的危害，然而，在其生產(chǎn)過(guò)程中尤為需要對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行快速的病毒檢測(cè).因此，本研究構(gòu)建了微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法，即用無(wú)菌大頭針刺馬鈴薯植株的莖尖，將粘附了組織汁液的針尖浸在RT-LAMP反應(yīng)液中，于65℃恒溫反應(yīng)60 min.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反應(yīng)液中先被M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶在針對(duì)馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白基因ORF3的2對(duì)引物（表1中F3／B3和 FIP／BIP）作用下進(jìn)行擴(kuò)增.其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段（見(jiàn)圖2B中的瀑布狀片段）.同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀-焦磷酸鎂.如有白色沉淀，即可判定為帶PLRV植株；如沒(méi)有白色沉淀的出現(xiàn)，即可判定為無(wú)病毒植株.

2.2 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法的可靠性 圖2A：馬鈴薯莖尖直接RT-LAMP反應(yīng)的肉眼觀察所得的結(jié)果.PCR管+：陽(yáng)性對(duì)照（已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品），反應(yīng)液中出現(xiàn)白色沉淀；PCR管-：陰性對(duì)照（未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品），反應(yīng)液清澈，無(wú)白色沉淀.圖2B：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析以微量組織汁液為模板直接RTLAMP法及RT-PCR法和以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP法及RT-PCR法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.泳道M：DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道W：以ddH2O為模板擴(kuò)增的結(jié)果；泳道-：未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測(cè)結(jié)果；泳道+：已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測(cè)結(jié)果：1）以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果；2）以莖尖汁液為模板直接擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果.

由圖2可知，微量組織汁液直接RT-LAMP檢測(cè)PLRV的結(jié)果與以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP檢測(cè)PLRV的結(jié)果一致，說(shuō)明微量組織汁液直接RT-LAMP檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒的方法是可靠、可行的.通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物中有無(wú)白色沉淀來(lái)判定植株是否感染病毒的方法與瓊脂糖凝膠電泳分析法的結(jié)果一致，說(shuō)明通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物中有無(wú)白色沉淀來(lái)判定植株是否感染病毒的方法是可靠、可行的.

圖2 利用引物對(duì)PLRV ORF3序列進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 Amplification results of PLRV ORF3 sequence using primers in RT-PCR and RT-LAMP

3 結(jié)束語(yǔ)

該方法不僅限于對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的檢測(cè)，還可通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)其它病毒靶基因序列的引物，應(yīng)用于其它病毒（如水稻黑條矮縮病毒［12］、草莓輕型黃邊病毒［13］）的檢測(cè)中.該方法與以往的檢測(cè)方法相比，具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn).1）迅速：該方法無(wú)需RNA提取，無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色，減少了至少2～3 h的檢測(cè)時(shí)間；2）操作簡(jiǎn)便：RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像的操作難度較大，需要具備一定操作技能的人員經(jīng)過(guò)一段時(shí)間反復(fù)試驗(yàn)才能掌握其操作技術(shù).該方法無(wú)需RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像，操作十分簡(jiǎn)便，任何人員都可迅速掌握其操作技術(shù)；3）成本低：RT-PCR檢測(cè)法需要PCR儀，然而一個(gè)價(jià)格最低的PCR儀花費(fèi)上萬(wàn)元.RT-PCR和RT-LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物需要瓊脂糖凝膠電泳成像進(jìn)行檢查和分析，然而價(jià)格最低的電泳儀和成像系統(tǒng)花費(fèi)上萬(wàn)元.該方法只需要一個(gè)任何實(shí)驗(yàn)室都具備的儀器——恒溫水浴鍋，因此大大減少了檢測(cè)成本.雖然該方法靈敏度不及RTPCR（如圖2B所示），但其所具有的3個(gè)優(yōu)點(diǎn)使其適用于對(duì)大規(guī)模脫病毒樣本的病毒檢測(cè)，在大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯、花卉和苗木生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用空間，而且它適用于任何一個(gè)植物病毒檢測(cè)機(jī)構(gòu)，特別是實(shí)驗(yàn)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、操作人員技能相對(duì)有限的基層機(jī)構(gòu).