二花臉豬卵巢卵泡發(fā)育過程中可溶性鳥苷酸環(huán)化酶和一氧化氮合酶活性變化及其定位

丁 威， 邢 軍， 周燕芬， 劉 晨， 魏全偉， 石放雄

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院，江蘇句容 212400； 2.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇南京 210095；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇南京 210014)

哺乳動物的卵巢是其生殖系統(tǒng)中的重要功能器官，主要包含卵泡、黃體。隨著卵泡的發(fā)育、閉鎖，顆粒細胞合成雌激素(E2)的功能發(fā)生明顯改變，而排卵后形成的黃體及黃體退化，進一步形成了孕酮的周期性變化，在這個過程中卵巢周期性變化又受到下丘腦-垂體-性腺軸的精準調控。除此以外，卵泡的形成和發(fā)育又受到胰島素樣生長因子(IGF-1)、鋅指轉錄因子4(GATA4)、叉頭轉錄因子1(foxo1)等多種因子的影響。研究表明，明星分子一氧化氮(NO)作為細胞間的信使，在卵泡發(fā)育及其生成類固醇激素等過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[1-3]。在動物體內，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，簡稱NOS)的主要功能是催化精氨酸分解生成NO，同時生成L-瓜氨酸。而NOS又是合成NO的限速酶，在調控NO合成過程中發(fā)揮關鍵作用。根據(jù)NOS對Ca2+的依賴性可將其分為2種類型：Ca2+依賴型[nNOS(neuronal nitric oxide synthase)、eNOS(endothelial nitric oxide synthase)]和非Ca2+依賴型[iNOS(inducible nitric oxide synthesis)]，而從結構和功能上可將其分為3種構型：神經(jīng)型(nNOS)、誘導型(iNOS)、內皮型(eNOS)，其中iNOS主要在巨噬細胞、嗜中性白細胞、內皮細胞及上皮細胞中表達[4-5]；nNOS主要在腦組織中表達，它是第1個被純化和克隆的同工酶[6-7]；eNOS基因在各種屬之間進化保守，且主要在血管內皮細胞中檢測到表達[8]。Stuehr等研究表明，多種細胞因子能夠改變iNOS在體內的生物學活性[9]。

在小鼠、大鼠、豬等動物的生殖系統(tǒng)中，研究人員對NOS進行了大量的研究[10-13]。Mitchell等在小鼠的卵母細胞、顆粒細胞以及膜細胞中均檢測到iNOS、eNOS的表達[14]。筆者所在實驗室前期研究結果表明，在卵母細胞中均檢測到NOS3種亞型的表達，且隨著卵泡的發(fā)育，NOS的表達量逐漸增加[15]。此外，也有相關研究報道，在卵巢的各類細胞中檢測到eNOS表達[16]。而僅在卵泡的顆粒細胞和黃體細胞中檢測到iNOS的表達[1，17-19]。nNOS在神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)等的細胞和組織中均有表達[20-22]。在豬卵巢上已有一些關于NOS的研究，但先前的研究結果并不一致[11，19，23-25]。目前，關于NOS在豬卵巢組織中的表達缺乏系統(tǒng)性的研究，而在早期卵巢形成和發(fā)育過程中，特別是關于胎兒期和出生期胎豬卵巢的NOS研究至今鮮有開展。

在細胞質中可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶能夠催化鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate，簡稱GTP)轉變?yōu)榄h(huán)鳥苷酸(guanosine 3′，5′-cyclic phosphate，簡稱cGMP)，而生成的cGMP在卵巢生成類固醇激素、促性腺激素受體的表達、顆粒細胞凋亡、卵泡排卵等方面具有非常重要的作用[26-30]。可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)含有α、β亞基，其中α含有α1、α2異構結構，β含有β1、β2異構結構[31-32]。前期研究結果表明，sGCα、sGCβ在大鼠卵巢腔前卵泡中的表達較強，而在有腔卵泡中的表達強度減弱[15，33]。由此可見，sGC在卵巢卵泡形成和早期發(fā)育過程中起到一定的作用。然而，關于sGC在豬卵巢卵泡形成及發(fā)育過程中的研究鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為性成熟、體質量接近的母豬，來自于南京農(nóng)業(yè)大學試驗豬場。試驗動物依據(jù)二花臉飼養(yǎng)標準進行普通飼養(yǎng)，在其發(fā)情周期啟始的24 h后進行人工授精，間隔12～24 h 復配1～2次，并將第1次配種日期記為懷孕0 d。選擇胎70日齡(70 dpc)、胎90日齡(90 dpc)、新生1日齡(1 dpp)和生后120日齡(120 dpp)等4個日齡階段的母豬各5頭，其中前3個日齡階段屬于出生前期，第4個日齡階段屬于出生后期。采集一側卵巢置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde，簡稱PFA)中固定36～48 h，以備進行組織學分析；采集另一側卵巢置于液氮中保存，用于酶活性測定。

1.2 試劑

3，3-二甲基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine etrahydrochloride，簡稱DAB)、3-氨基-丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，簡稱APES)、兔抗sGCα和兔抗sGCβ等來源于Sigma公司；兔多克隆抗體nNOS(BA0360)、iNOS(BA0362)、eNOS(BA0364)和羊抗兔IgG(BA1054)、NOS測定試劑盒、動物切片石蠟等均為國產(chǎn)試劑。

1.3 儀器

RM2235切片機(Leica)、HI1220烘片機(Leica)、YS100顯微鏡(Nikon)、iMark酶標儀(BioRad)、DHG-9073BS-III電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、2XZ-2真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、DZF-6020真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、KD-P展片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、YD-6D包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、TY-80S脫色搖床(南京大學)。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化染色

脫蠟止水：二甲苯Ⅰ7 min→二甲苯Ⅱ7 min→100%乙醇Ⅰ 5 min→100%乙醇Ⅱ 5 min→90%乙醇5 min→70%乙醇 2 min→蒸餾水5 min；滅活內源酶：用3%甲醇-H2O2處理15 min→蒸餾水5 min；抗原熱修復：檸檬酸三鈉(pH值=6.0)100 ℃ 10 min→磷酸鹽緩沖液(phasphate buffered saline，簡稱PBS)洗滌3次，每次3 min；加一抗：10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，簡稱BSA)室溫封閉30 min→一抗加入后，須要在室溫條件下過夜，陰性對照可用1% BSA代替(nNOS、iNOS、eNOS抗體稀釋濃度為1 ∶100，sGCα、sGCβ抗體稀釋濃度為1 ∶2 000) →PBS洗滌3次，每次3 min；鏈霉素親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex，簡稱SABC)反應：二抗加入后，須要在室溫條件下30 min→PBS洗滌3次，每次3 min→加SABC，室溫 15 min→PBS洗滌3次，每次3 min；顯色：0.05% DAB+0.01% H2O2，顯色2～10 min→流水沖洗5 min→蘇木素復染→流水沖洗5 min；脫水透明：50%乙醇2 min→70%乙醇2 min→90%乙醇2 min→100%乙醇Ⅰ 2 min→100%乙醇Ⅱ 2 min→二甲苯Ⅰ 4 min→二甲苯Ⅱ 4 min；封片觀察。

1.4.2 卵巢組織中的酶活性測定 NOS等活性測定方法參見筆者所在實驗室前期研究方法[15]，檢測步驟參照操作說明。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應用Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行錄入與處理，計算平均數(shù)、標準差等特征值；采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，差異顯著性檢驗采用Turkey檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 NOS在豬卵巢卵泡形成和發(fā)育過程中的表達

eNOS抗體免疫組化試驗結果表明，eNOS在豬卵巢卵母細胞巢(圖1-A、圖1-B、圖1-C)、各級卵泡卵母細胞(圖1-D、圖1-E)、卵巢表皮細胞(圖1-B)和多層卵泡的顆粒細胞層及膜細胞層(圖1-F、圖1-G、圖1-H)中均有表達，且在顆粒細胞、膜細胞中的表達隨著卵泡的發(fā)育而增強。此外，eNOS在黃體(圖1-I)中也有表達，對照組無表達(圖1-J)。

iNOS抗體免疫組化試驗結果表明，iNOS在卵巢表皮細胞(圖2-A、圖2-G)、各級卵泡的卵母細胞(圖2-B、圖2-C、圖2-E、圖2-G)、卵母細胞透明帶(圖2-C、圖2-G)、多層卵泡的顆粒細胞(圖2-C、圖2-E、圖2-F、圖2-G)、膜細胞(圖2-C、圖2-E、圖2-F)、間質細胞(圖2-F)、血管內皮細胞(圖2-D)和黃體細胞(圖2-G)中均有表達，但在單層卵泡的顆粒細胞層中未見表達，對照組無表達(圖2-H)。

用抗nNOS抗體對豬卵巢組織進行免疫組織化學檢測，結果表明，nNOS和eNOS的表達定位基本一致，具體情況見圖3。

2.2 sGCα1和sGCβ1在豬卵泡形成和早期發(fā)育過程中的表達

sGCα1抗體免疫組化試驗結果表明，sGCα1在腔前卵泡的顆粒細胞、卵巢組織血管內皮細胞、黃體細胞、卵母細胞巢中均有較強表達，在卵泡膜細胞中的表達較弱。sGCβ1的表達位置和程度與sGCα1基本一致，具體情況見圖4。

2.3 卵巢中NOS活性測定

各日齡階段豬卵巢中一氧化氮合酶活性的測定結果(圖5)表明，在出生前期，隨著日齡增加，卵巢中總NOS活性升高，胎70日齡組總NOS活性顯著低于胎90日齡和新生1日齡組，新生1日齡組和胎90日齡組之間差異不顯著，生后120日齡組顯著低于出生前期各組；胎90日齡組卵巢中的eNOS活性顯著高于其他組；新生1日齡組卵巢中的iNOS活性顯著高于其他組；各組之間卵巢中的nNOS活性差異不顯著，其中以胎70日齡最高，生后120日齡最低。

3 討論

前期研究表明，NO、NOS在調控哺乳動物卵泡發(fā)育和卵巢功能過程中發(fā)揮重要的作用[10，34-38]，本試驗對胎豬和新生仔豬卵巢中的NOS、sGC表達與卵泡發(fā)育進行研究，結果表明，NOS和sGC在卵泡發(fā)育過程中呈細胞特異性表達。

本試驗中，eNOS主要在卵泡顆粒細胞、卵泡膜細胞、卵母細胞中表達，同時還發(fā)現(xiàn)，在胎豬和新生仔豬的卵巢卵母細胞中有eNOS表達。Jablonka-Shariff等研究發(fā)現(xiàn)，在敲除eNOS基因的小鼠中，其卵巢有腔卵泡的數(shù)量和排卵率等指標下降顯著[38]。綜合上述結果表明，在豬早期卵巢卵泡的形成和發(fā)育過程中，eNOS發(fā)揮了重要的作用。此外，本試驗中nNOS、iNOS、eNOS的表達定位基本一致，這與Kim等的試驗結果[11]基本一致。而Matsumi等研究表明，在大鼠卵巢中，只有eNOS、iNOS表達，而未檢測出nNOS[39]，說明nNOS的表達存在種屬差異性，但在豬卵巢中，nNOS和eNOS、iNOS都參與原始卵泡的形成及發(fā)育過程。

本試驗中NOS活性測定結果表明，卵巢中總NOS活性，出生前期顯著高于出生后120日齡，且從胎70日齡至新生1日齡階段，有逐漸上升的趨勢，說明NOS在出生前期卵巢內發(fā)揮更重要的調控作用；eNOS在胎豬90日齡的卵巢中表達量最高，結合此階段為原始卵泡形成與發(fā)育的關鍵時期的特點進行分析，說明eNOS在參與響應卵巢原始卵泡的形成和原始卵泡的激活過程中發(fā)揮了重要的作用，但仍須深入研究其具體機制。檢測結果發(fā)現(xiàn)，iNOS在新生1日齡的仔豬卵巢中表達量最高。而在哺乳動物細胞中，iNOS極易受到細胞因子等多種物質和外部環(huán)境的影響[9]。這可能是由于胎兒出生后，外部環(huán)境急劇改變，仔豬應激反應引起卵巢中iNOS表達升高。筆者所在實驗室前期研究結果表明，新生卵巢組織中孕激素和雌激素的含量顯著低于胎兒時期，iNOS的階段特異性變化是否與激素含量等因素有關，還有待進一步研究。在本試驗中nNOS的活性明顯低于iNOS、eNOS，結合筆者所在實驗室先前的研究結果，總NOS活性主要依賴于eNOS、iNOS等2種酶，而nNOS對總NOS活性的貢獻較少[15]。由此可以推斷，在豬卵巢卵泡形成和發(fā)育過程中起主要作用的NOS是eNOS、iNOS等2種類型。

NO通過激活sGC來提高細胞內的cGMP水平，以發(fā)揮多種生理作用[40]。細胞內的NO能夠與sGC的二聚體結合，活化sGC，從而提高cGMP的產(chǎn)量[41]。本試驗首次對sGCα1、sGCβ1在豬卵巢組織中的表達進行定位，結果表明，sGC在腔前卵泡的顆粒細胞、卵巢組織血管內皮細胞、黃體細胞、卵母細胞巢中均有較強表達，在卵泡膜細胞中的表達較弱，并隨著卵泡的不斷發(fā)育增大，顆粒細胞中sGCα1、sGCβ1的表達量下降，這一研究結果與筆者所在實驗室前期在大鼠上獲得的試驗數(shù)據(jù)[15，33]是一致的。隨著卵泡的持續(xù)增大，sGC表達量下降，其細胞內合成的cGMP量必定減少。這與前人關于NO、cGMP能夠拮抗顆粒細胞成熟的研究結論[42-44]是相符的。綜上所述，sGC能夠調節(jié)早期卵泡的發(fā)育，且其表達水平與顆粒細胞增殖呈負相關關系。研究發(fā)現(xiàn)，NOS主要在早期卵泡的卵母細胞中高表達，而sGC主要在顆粒細胞中表達。由于NO是氣體分子，作為生物信使具有很強的擴散性，可以自由通過臨近細胞膜，從而發(fā)揮其調節(jié)作用，因此，雖然NOS主要在卵母細胞中表達，但其催化產(chǎn)生的NO可以通過氣體擴散作用進入周圍的顆粒細胞。