蒸發(fā)光散射檢測(cè)器－高效液相色譜法測(cè)定小兒化毒膠囊中膽酸和豬去氧膽酸含量

吳 芳 ，羅定強(qiáng) ，李 青 ，趙珊珊 ，劉海靜 ，

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046）

小兒化毒膠囊有清熱解毒、活血消腫功效，用于小兒疹后余毒未盡、煩躁、口渴、口瘡、便秘等癥?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（第50冊(cè)）》，原處方規(guī)定使用牛黃投料，后根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)文件，經(jīng)批準(zhǔn)將處方中的牛黃修改為人工牛黃進(jìn)行投料，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)為使用薄層色譜法測(cè)定人工牛黃中膽酸的含量，方法的專屬性和重復(fù)性均欠佳。該品種的系列制劑小兒化毒散現(xiàn)收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，標(biāo)準(zhǔn)中亦缺少對(duì)人工牛黃的定量控制方法[1]。小兒化毒膠囊為兒科用藥，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)予以更合理和嚴(yán)格的控制。本研究中采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器－高效液相色譜（ELSD－HPLC）法同時(shí)測(cè)定方中膽酸和豬去氧膽酸的含量，方法科學(xué)、簡(jiǎn)便，可有效控制小兒化毒膠囊中人工牛黃的質(zhì)量，并可為同系列制劑提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters1525／2487型高效液相色譜儀，Empower色譜工作站（美國(guó) Waters公司）；BS224S型，BS223S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Alltech ELSD3300ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰科技＜中國(guó)＞有限公司）。

1.2 試藥

膽酸對(duì)照品（批號(hào)為 100078－201415，含量為98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為100087－200610，含量為97.3%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。小兒化毒膠囊樣品共9批（批號(hào)分別為20091，10021，60161，10011，10061，10031，10051，60171，20081），陰性樣品及人工牛黃藥材均由西安碑林藥業(yè)股份有限公司提供，且由羅定強(qiáng)副主任藥師鑒定，符合藥典相關(guān)規(guī)定。乙腈為色譜純（Avantor Performance Materials Sda Bhd），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2－5]

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0.1% 冰醋酸溶液（40 ∶60）；ELSD 漂移管溫度：98℃；空氣流速：3.0 mL／min；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取膽酸對(duì)照品和豬去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中各含0.2 mg的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液與陰性對(duì)照品溶液：分別取小兒化毒膠囊內(nèi)容物、陰性樣品適量，研細(xì)，取約3 g；人工牛黃研細(xì)，取約 45 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，用適量甲醇洗滌容器和濾紙，合并濾液，蒸至近干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取膽酸對(duì)照品10.80 mg（含量為98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品11.52 mg（含量為97.3%），精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，折純度后質(zhì)量濃度分別為1.068 g／L和1.121 g／L；分別吸取 1，2，3，5，8，10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：膽酸 Y＝1.46X＋5.83（r＝0.999），豬去氧膽酸 Y＝1.46 X＋5.68（r＝0.999），膽酸進(jìn)樣量線性范圍為1.068～10.680 μg，豬去氧膽酸進(jìn)樣量線性范圍為 1.121 ～ 11.210 μg。

專屬性試驗(yàn)：取陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果未出現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜中膽酸與豬去氧膽酸對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見圖1。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件操作，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸峰面積積分值的 RSD分別為2.90%和2.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取同一供試品（批號(hào)為20081），依法制備供試品溶液，分別于配制后每隔4 h測(cè)定。結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸峰面積積分值的 RSD分別為3.0%和2.1%（n＝6），表明供試品溶液在20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20081）樣品6份，依法制備供試品溶液,測(cè)定。結(jié)果膽酸的平均含量為0.774 mg／g，RSD 為 2.23% （n＝6）；豬去氧膽酸的平均含量為 1.050 mg／g，RSD 為 2.71% （n＝6）。平均裝量為0.312 2 g，每粒含有膽酸和豬去氧膽酸的總量為0.570 mg。

加樣回收試驗(yàn)：取膽酸對(duì)照品14.54 mg，豬去氧膽酸對(duì)照品14.60 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取6份溶液各1 mL，置錐形瓶中，再精密稱取6份樣品（批號(hào)為20081）各1 g，分別依次置上述錐形瓶中，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果見表1。

2.4 膽酸和豬去氧膽酸轉(zhuǎn)移率

取人工牛黃藥材適量，制備供試品溶液，測(cè)得人工牛黃中膽酸的含量為5.05%，豬去氧膽酸的含量為7.23%。按其含量及處方進(jìn)行計(jì)算，樣品中膽酸的轉(zhuǎn)移率為96.5%，豬去氧膽酸的轉(zhuǎn)移率為91.5%。

2.5 樣品含量與限度測(cè)定

依法測(cè)定8批樣品含量，結(jié)果為每粒0.570～0.659 mg。按此結(jié)果，考慮批間差異、藥材差異等的影響，含量限度暫定為：本品每粒含人工牛黃以膽酸（C24H40O5）和豬去氧膽酸（C20H27O11）的總量計(jì)，不得少于0.40 mg。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

人工牛黃中的膽酸為膽甾酸類成分，分子結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛雙鍵，在紫外－可見光區(qū)吸收不明顯?！吨袊?guó)藥典（一部）》人工牛黃項(xiàng)下收載的含量測(cè)定方法及方法后附的原料含量測(cè)定方法均為采用糠醛溶液顯色后進(jìn)行紫外測(cè)定。另有采用薄層色譜法[6]或高效液相色譜－紫外檢測(cè)（HPLC－UV）法測(cè)定膽酸和豬去氧膽酸的含量[7－8]。但經(jīng)試驗(yàn)，兩者色譜峰在紫外檢測(cè)器下響應(yīng)值很低，且受其他成分干擾，色譜峰幾乎難以辨認(rèn)。在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器下信號(hào)較強(qiáng)，色譜峰響應(yīng)值較大，與周圍色譜峰分離良好。故蒸發(fā)光散射檢測(cè)器用來(lái)測(cè)定膽酸類物質(zhì)較為理想[9]。

考察超聲提取30 min、回流提取30 min、回流提取40 min 3種提取方式，結(jié)果回流提取30 min制備的供試品溶液中膽酸和豬去氧膽酸的含量最高。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，選定回流提取30 min為溶液的提取方式。

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等加工制成[1]，膽酸和豬去氧膽酸為其中含量最高的2種化學(xué)成分，質(zhì)量控制方法研究較成熟[10－12]。人工牛黃為天然牛黃的代用品，部分含有天然牛黃的制劑品種使用人工牛黃進(jìn)行替代，但標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下并未進(jìn)行相應(yīng)的檢驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目的完善和提高，建議應(yīng)及時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提高工作，完善人工牛黃的質(zhì)量控制方法。