奶牛乳房炎中藥注射劑的制備

高 翔，韓克光

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

奶牛乳房炎是由于奶牛乳腺組織在擠奶時(shí)受到刺激或者由于環(huán)境衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理等環(huán)節(jié)中受微生物感染后引起的一系列炎癥反應(yīng)[1-2]，最終導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降、乳汁廢棄、病牛被淘汰以及治療費(fèi)用的增加。奶牛乳房炎由于發(fā)病率高且久治難愈，預(yù)防及治療困難為奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，全球每年因奶牛乳房炎帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)300多億美元。因?yàn)橄鄬?duì)于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家而言，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)仍處于較低水平，每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)150億～450億元[3]。

在乳房炎的治療方面，抗生素療法起效快，治愈率高，但長(zhǎng)期及大劑量的使用，造成耐藥菌株的增加，牛奶中殘留大量抗生素，給人類帶來(lái)嚴(yán)重的安全隱患。張咚咚等[4]對(duì)奶牛乳房炎的細(xì)菌分離及耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，致病菌對(duì)常用抗生素青霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟等藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。

與抗生素相比，中草藥具有耐藥性低、體內(nèi)代謝快、殘留小等優(yōu)點(diǎn)[5]，并且兼具預(yù)防與治療的效果，能夠提高機(jī)體免疫力。但是傳統(tǒng)中藥劑型，如散劑、煎劑、灌注劑等，由于用量大、藥效低、不易運(yùn)輸、保存期短等缺點(diǎn)，在動(dòng)物臨床應(yīng)用中局限性大。張玲等[6]選取了6味中藥制備成中藥散劑，治療效果良好，提高了產(chǎn)奶量，但是所需散劑劑量大，不易保存，易受潮變質(zhì)。王金君等[7]選取了10味中藥制備成煎劑，對(duì)患病奶牛進(jìn)行灌服，治愈率可達(dá)80%以上，說(shuō)明該煎劑對(duì)奶牛乳房炎有較好的治療效果，但是在制備中時(shí)間長(zhǎng)、提取溫度高，容易造成一些對(duì)熱敏感的有效成分流失。張振國(guó)等[8]選取了7味中藥制備成乳房灌注劑，對(duì)患病奶牛進(jìn)行了4 d的乳區(qū)灌注，治愈率高達(dá)90%，但是在灌注過(guò)程中，由于奶牛乳房的倒置結(jié)構(gòu)，藥物注入乳池后部分藥液流出，乳管易堵塞，導(dǎo)致藥物分布不均，影響治療效果。而中藥注射劑的研制彌補(bǔ)了上述中藥治療的缺陷，打破了中藥固有的給藥模式，其具有起效快、生物利用度高、毒性小、易攜帶儲(chǔ)存等特點(diǎn)。唐靜靜等[9]制備的金英黃歸注射液，薛占永等[10]制備的新型復(fù)方蒲公英中藥注射液及周緒正等[11]制備的“乳源康注射液”對(duì)奶牛乳房炎的治療均表現(xiàn)出較好的效果。中藥注射劑的制備是將中藥通過(guò)煎煮、蒸餾等步驟對(duì)其中有效成分進(jìn)行提取。但提取液雜質(zhì)較多，需要進(jìn)一步提純精制，在制備過(guò)程中如何減少有效成分的損失，提高其穩(wěn)定性，是研制中藥注射劑亟需解決的難題。

本試驗(yàn)通過(guò)超聲提取法提取和ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法純化制備中藥注射劑，依據(jù)國(guó)家藥典對(duì)注射液進(jìn)行一系列的質(zhì)量及安全性檢測(cè)，且在符合規(guī)定后進(jìn)一步檢驗(yàn)其抑菌消炎效果，從而建立奶牛乳房炎中藥注射劑制備方法，為奶牛乳房炎的治療提供新的手段。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

乳香、蒲公英、金銀花、黃芩等藥材購(gòu)自山西省太谷縣醫(yī)藥藥材公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

超聲波清洗器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式真空泵，4℃冰箱，高效液相色譜儀。

1.3 處方的選擇

根據(jù)奶牛乳房炎的發(fā)病機(jī)制，以及在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，蒲公英具有抑菌抗炎、消腫散結(jié)的功效[12]；黃芩具有清熱解毒、抗菌、提高機(jī)體免疫力的功效[13]，在對(duì)奶牛乳房炎治療和預(yù)防時(shí)，可與蒲公英作為首選藥物進(jìn)行配伍組方[14]；金銀花具有消炎、抗菌、抗病毒的功效[15]，能夠有效提高蒲公英的治療效果；乳香具有消炎抗腫，止痛的功效[16]。通過(guò)與多位臨床獸醫(yī)及老師的研究，選用上述4味中藥材作為制備中藥注射劑的處方。

1.4 復(fù)方提取液的制備

與傳統(tǒng)煎煮法相比，超聲提取法對(duì)中藥有效成分提取率高、時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單，適用于大多數(shù)中藥材[17-18]。按處方稱取中藥材，藥材粉碎后過(guò)0.42 mm篩，稱取100 g粉碎后的中藥粉末，添加75%乙醇（10倍量），浸泡過(guò)夜，20 kHz超聲處理40 min，雙層紗布過(guò)濾，剩下的藥渣再加75%乙醇（8倍量），超聲處理20 min，雙層紗布過(guò)濾，合并2次濾液，減壓回收乙醇，生藥質(zhì)量濃度濃縮為1 g/mL，4℃冷藏備用。

1.5 提取液純化方法的篩選

1.5.1 ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法（包括A，B共2個(gè)組分） 依說(shuō)明書(shū)及參考文獻(xiàn)配制A，B組分溶液[19]。A組分：稱取A組分粉末2 g，先用少量水調(diào)成糊狀，然后加適量純水定容至200 mL，待膨脹24 h后攪拌過(guò)濾即得1%黏膠液；B組分：稱取B組分粉末2 g，加入少量1%醋酸溶液，攪拌溶解至糊狀，然后加1%醋酸定容至200 mL，待膨脹24 h后攪拌過(guò)濾即得1%黏膠液。取200 mL生藥濃度為1 g/mL的提取液，等分為 4 份，標(biāo)記為 1，2，3，4 組，水浴加熱至80℃，慢速攪拌的同時(shí)分別加入A組分黏膠液4，8，12，16 mL，每隔 30 min 左右攪拌一次，2 h 后，于80℃下按同法對(duì)應(yīng)加入制備好的B組分黏膠液2，4，6，8 mL，保溫 10 min，30 min 后再攪拌一次，靜置6 h后過(guò)濾。過(guò)濾后沉淀烘干稱質(zhì)量，濾液進(jìn)行鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、澄清度檢查，調(diào)pH值為6.5，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.5.2 改良明膠沉淀法 取150 mL生藥濃度為1 g/mL的提取液，等分為 4 份，標(biāo)記為 5，6，7，8 組，水浴加熱至50℃后一邊快速攪拌，一邊緩慢加入5%的明膠水溶液，觀察，當(dāng)上清液不出現(xiàn)沉淀時(shí)停止加入。靜置30 min，加無(wú)水乙醇使乙醇含量為70%，75%，80%，85%，冷藏過(guò)夜后過(guò)濾，沉淀烘干后稱質(zhì)量記錄，減壓回收乙醇，濾液進(jìn)行鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、澄清度檢查，然后將生藥濃度調(diào)成1 g/mL，調(diào)節(jié)pH值為6.5，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，記錄抑菌圈的直徑。

1.6 質(zhì)量檢查

1.6.1 澄清度檢查 通過(guò)眼睛觀察檢測(cè)。取100 mL注射液裝于無(wú)色玻璃瓶中，背部襯一塊黑布，底部襯一塊白布用來(lái)鑒別有色異物，將藥液與人眼放于同一水平線并相距20 cm左右，豎放、橫放、倒放檢查，每次15 s左右。

1.6.2 pH測(cè)定 取3批注射液各20 mL，用pH儀分別測(cè)定pH，計(jì)算平均值。

1.6.3 鞣質(zhì)檢查 取3批注射液各1 mL，依次滴加1%蛋清生理鹽水溶液3 mL（現(xiàn)用現(xiàn)配），靜置5 min，觀察是否出現(xiàn)渾濁或沉淀。

1.6.4 樹(shù)脂檢查 取3批注射液各5 mL于分液漏斗中，然后加10 mL三氯甲烷輕輕振蕩，取上層的三氯甲烷，放在水浴上加熱至蒸干，蒸干后剩下的固體物質(zhì)添加2 mL冰醋酸，待其溶解后，放入具塞試管中，加3 mL水混勻后靜置30 min，觀察有無(wú)樹(shù)脂狀物析出。

1.6.5 蛋白質(zhì)檢查 取3批注射液各1 mL，分別滴加3滴鞣酸試劑，觀察是否出現(xiàn)渾濁。

1.7 高效液相色譜法

1.7.1 色譜條件 Waters1525高效液相色譜儀，2489紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，C18色譜柱（250 nm×4.6 nm，5 μm），流動(dòng)相為 0.4%磷酸溶液與乙腈，選取322 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)樣量20 μL，流速控制在1 mL/min，洗脫時(shí)間30 min，柱溫25℃。

1.7.2 對(duì)照品與供試品溶液配制 乳香、蒲公英、金銀花和黃芩的主要有效成分分別為11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷[20-23]。精密稱取11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品6 mg，咖啡酸對(duì)照品10 mg及黃芩苷對(duì)照品18 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋后定容，備用；稱取綠原酸對(duì)照品10 mg，加水溶解，稀釋后定容，備用。分別吸取配制好的4種儲(chǔ)備液各1 mL，置于棕色容量瓶中加水稀釋，定容至刻度后搖勻，即得混合對(duì)照品溶液；吸取制備的中藥注射液1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中加水稀釋，定容至刻度后搖勻，過(guò)濾即得供試品溶液。

1.7.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取配制均勻的混合對(duì)照品溶液20 μL，按照1.7.1色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所測(cè)量的色譜峰面積。

1.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取中藥注射液供試品溶液 20 μL，按照 1.7.1 色譜條件，分別在 0，4，8，12，24，48 h進(jìn)樣20 μL，記錄所測(cè)量的色譜峰面積。

1.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密吸取同一批中藥注射液供試品5份，按照1.7.1色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所測(cè)量的色譜峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法純化結(jié)果

從表1可以看出，處理2（A組分加入8 mL，B組分加入4 mL）質(zhì)量檢查合格，澄清度良好，且對(duì)3種病原菌抑菌效果最佳。A，B組分不同的加入量在蛋白質(zhì)與鞣質(zhì)的處理上面均合格，但并不是隨著加入量的增加而對(duì)雜質(zhì)的吸附與澄清效果越好，當(dāng)澄清劑加入量達(dá)到飽和后反而達(dá)不到更好的絮凝沉積效果。

2.2 改良明膠沉淀法純化結(jié)果

從表2可以看出，該方法對(duì)鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)的清除效果較好，檢測(cè)結(jié)果符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，并且澄清度良好，對(duì)病原菌的抑菌效果能達(dá)到中敏程度以上。

表2 改良明膠沉淀法試驗(yàn)結(jié)果

2.3 澄清度檢查結(jié)果

注射劑整體清亮，豎放、橫放、倒放均沒(méi)有觀察到微粒，澄清度檢查結(jié)果合格。

2.4 pH測(cè)定結(jié)果

從表3可以看出，3批注射液的pH值之間相差都不超過(guò)1，并且pH值在4～9，符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表3 pH測(cè)定結(jié)果

2.5 鞣質(zhì)檢查結(jié)果

注射液加新鮮配制的1%蛋清生理鹽水溶液靜置等待后，藥液仍然澄清，沒(méi)有出現(xiàn)沉淀，檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.6 樹(shù)脂與蛋白質(zhì)檢查

溶解物加水混勻靜置30 min后，沒(méi)有樹(shù)脂狀物析出；注射液加入鞣酸后，藥液澄清，檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.7 高效液相色譜法試驗(yàn)結(jié)果

在精密度試驗(yàn)中，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.41%，0.43%，0.39%，0.37%；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.82%，0.89%，0.77%，0.72%；在重復(fù)性試驗(yàn)中，各色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.75%，0.79%，0.72%，0.69%。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在該試驗(yàn)中，儀器精密度良好，中藥注射液供試品在2 d內(nèi)較穩(wěn)定，且該方法重復(fù)性較好。

3 討論與結(jié)論

中藥注射劑的質(zhì)量控制不僅是針對(duì)單一的某個(gè)環(huán)節(jié)，而是貫穿整個(gè)制備過(guò)程。澄清度作為評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性與質(zhì)量的主要指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。由于中藥注射劑成分復(fù)雜，在生產(chǎn)過(guò)程中溫度、酸堿度的變化及附加劑的不合理使用，會(huì)影響注射劑色澤、產(chǎn)生沉淀；鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等如果沒(méi)有除盡，不僅會(huì)影響澄清度，還會(huì)降低藥效，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)[24-25]。因此，生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)對(duì)制備工藝嚴(yán)格要求，尋求最佳配伍，從而提高中藥注射劑的質(zhì)量。

從提取液純化方法的篩選中來(lái)看，ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法，通過(guò)比較不同的加入量，可以發(fā)現(xiàn)各方面均合格，在蛋白質(zhì)與鞣質(zhì)處理中沒(méi)有太大差別，A組分4%、B組分2%沉淀量略高于其他比例，并且在澄清程度上也好于其他比例。改良明膠沉淀法中，在蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)處理、澄清程度、抑菌效果上，各方面指標(biāo)均合格，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制方面可達(dá)到高度敏感；在處理沉淀方面，加入明膠水溶液處理一段時(shí)間后，直接加入乙醇后使明膠變性形成大塊兒沉淀，便于過(guò)濾[26]，但是各方面結(jié)果略差于ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法。

高效液相色譜法是對(duì)中藥材進(jìn)行質(zhì)量分析的一種常用方法，其通過(guò)對(duì)中藥材中主要有效成分的分析，能夠全面的反映出中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣及注射劑中有效成分含量[27]。在200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)各對(duì)照品進(jìn)行掃描可知，11-羰基-β-乙酰乳香酸、咖啡酸、綠原酸與黃芩苷在322 nm波長(zhǎng)均有較大吸收；通過(guò)比較不同流動(dòng)相的洗脫效果，選定0.4%磷酸溶液與乙腈為流動(dòng)相，故最終采用同一色譜條件進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)主要有效成分的分離度較高、重復(fù)性好，且時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單，可作為中藥注射劑有效成分的測(cè)定方法。

采用超聲提取法和ZTC1+1澄清劑沉淀吸附法制備得到的注射液，經(jīng)澄清度檢查、pH測(cè)定、高效液相色譜法等一系列檢查后，所得試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定，成功制備了防治奶牛乳房炎的中藥注射劑。