大花序桉組培快繁技術(shù)及其無(wú)性系造林效果的初步評(píng)價(jià)

唐再生，王建忠，莫繼有，熊濤，張磊，李麗芳，蘭俊

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大花序桉組培快繁技術(shù)及其無(wú)性系造林效果的初步評(píng)價(jià)

唐再生，王建忠，莫繼有，熊濤，張磊，李麗芳，蘭?。?/p>

(廣西國(guó)有東門(mén)林場(chǎng)，廣西 扶綏 532108)

采用16 ~ 30 a生大花序桉優(yōu)樹(shù)伐樁萌芽，經(jīng)無(wú)菌芽誘導(dǎo)、叢芽增殖、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、甁苗移栽、組培苗造林等技術(shù)環(huán)節(jié)的研究，篩選出一組適合大花序桉生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，建立以芽繁芽的組培快繁體系，獲得實(shí)用的移栽和造林方法，形成一整套可面向規(guī)模化生產(chǎn)和推廣造林的大花序桉組培快繁技術(shù)，其中無(wú)性系CL1的生根率達(dá)到88.9%，甁苗移栽成活率達(dá)到82.7%，試生產(chǎn)組培苗10萬(wàn)株，出圃造林近70 hm2，初具組培苗工廠化生產(chǎn)規(guī)模；對(duì)幼林觀測(cè)測(cè)定結(jié)果表明：遺傳性狀穩(wěn)定，再生植株能保持原株的優(yōu)良遺傳性狀，林相整齊，速生豐產(chǎn)效果顯著。

大花序桉；組培快繁；無(wú)性系造林

大花序桉()又叫昆士蘭桉，天然分布在澳大利亞昆士蘭州。它生長(zhǎng)迅速，樹(shù)高可達(dá)30 ~ 40 m，直徑1 ~ 2 m，干形通直圓滿，自然整枝良好，是一種重要實(shí)木利用的桉樹(shù)樹(shù)種。大花序桉的木材黃褐色，硬度高，紋理通直，結(jié)構(gòu)均勻，耐久持重，鋸板性能優(yōu)良，是一種天然高貴木材[1]。因?yàn)樯L(zhǎng)快，干形好，材質(zhì)優(yōu)良，是商品經(jīng)營(yíng)培育大徑材的優(yōu)良樹(shù)種。其輪伐期比尾巨桉()稍長(zhǎng)，可以改善尾巨桉短周期經(jīng)營(yíng)超強(qiáng)收獲而引起的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，對(duì)于實(shí)現(xiàn)桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。廣西國(guó)有東門(mén)林場(chǎng)從1983年中澳東門(mén)桉樹(shù)項(xiàng)目開(kāi)始，3次引種大花序桉，建立種源試驗(yàn)，結(jié)果表明大花序桉適合東門(mén)及附近地區(qū)生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出優(yōu)良特性[2]。

目前大花序桉未能實(shí)現(xiàn)規(guī)模推廣種植，主要原因在于苗木繁育困難。一是結(jié)實(shí)量少，種子發(fā)芽率低。造林用種依賴(lài)進(jìn)口，育苗成本高昂，而且實(shí)生苗造林后林相不整齊，分化明顯。二是大花序桉屬于難生根樹(shù)種，扦插生根極難。組培育苗雖然經(jīng)過(guò)不少探索，陸續(xù)發(fā)表了一些大花序桉組培研究的報(bào)告，并取得了一些進(jìn)展[3]，但到目前為止，尚無(wú)面向生產(chǎn)推廣的完整技術(shù)，未見(jiàn)大花序桉組培苗造林的報(bào)道。

育苗能否成功，決定了大花序桉的種植規(guī)模和能否持續(xù)發(fā)展。為打破這制約發(fā)展的瓶頸，東門(mén)林場(chǎng)林科所在2002年開(kāi)展了大花序桉組培快繁技術(shù)的探索，并取得了初步成果，證明大花序桉能夠通過(guò)組培進(jìn)行無(wú)性繁殖[4]。2014年，在原來(lái)研究的基礎(chǔ)上，再次進(jìn)行深入研究，離體快繁技術(shù)取得成功，培育了無(wú)性系CL1和CL8，初步實(shí)現(xiàn)大花序桉組培無(wú)性系造林的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從東門(mén)林場(chǎng)1983年、1989年和2001年建立的大花序桉種源試驗(yàn)林中，選出優(yōu)良種源/家系，再選出優(yōu)良單株。單株選擇時(shí)，注重生長(zhǎng)量和干形指標(biāo)，并考慮樹(shù)體周?chē)帜旧L(zhǎng)情況等綜合因素，排除孤立木、林緣木、畸形木，通過(guò)伐倒促萌的方法，獲得組培快繁原材料—優(yōu)樹(shù)萌芽，并對(duì)優(yōu)樹(shù)編號(hào)(CL1、CL2、CL3、…CL12)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 優(yōu)樹(shù)萌芽的處理

1.2.1.1 觀察記錄萌芽形態(tài)特征及分類(lèi)

觀察記錄優(yōu)樹(shù)萌芽的叢數(shù)，芽條數(shù)，枝和葉的形態(tài)特征，生長(zhǎng)勢(shì)等情況，匯總后分類(lèi)。

1.2.1.2 外植體選擇和表面消毒滅菌

對(duì)伐樁萌芽作必要的修剪、病蟲(chóng)害防治處理。當(dāng)萌條適合作組培時(shí)，選取生長(zhǎng)正常，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)畸形，具有半木質(zhì)化莖段的萌條，采集帶回試驗(yàn)室，然后修剪去掉葉片和側(cè)芽，留少許葉柄，切取長(zhǎng)2 ~ 3 cm，含有潛伏芽的頂稍幼嫩莖段和半木質(zhì)化莖段，用純凈水清洗10 min，然后在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精浸泡10 ~ 20 s，無(wú)菌水清洗3次；再用0.1%升汞溶液浸泡5 ~ 8 min，無(wú)菌水清洗5次。用經(jīng)過(guò)滅菌處理的干濾紙吸去莖段表面附著的水分，在接種碟上，用手術(shù)刀或手術(shù)剪將莖段切割成含有1 ~ 2個(gè)潛伏芽，長(zhǎng)度1.0 ~ 1.5 cm的小段，接種到無(wú)菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。觀測(cè)記錄污染、褐化、萌芽其情況，累計(jì)多次誘導(dǎo)的結(jié)果。

1.2.2 外植體無(wú)菌芽促萌方法

誘導(dǎo)無(wú)菌芽選用改良MS培養(yǎng)基。添加6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1，并根據(jù)不同無(wú)性系特點(diǎn)，調(diào)整6-BA和NAA的濃度，蔗糖3%，瓊脂4.0 ~ 5.0 g?L-1，按瓊脂強(qiáng)度大小調(diào)整用量。pH值調(diào)至5.8 ~ 6.2。接種后全暗培養(yǎng)9 ~ 12 d，萌發(fā)芽點(diǎn)后，移至自然散射光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度由弱逐漸增強(qiáng)。

1.2.3 無(wú)菌芽繼代增殖培養(yǎng)

1.2.3.1 預(yù)備試驗(yàn)

通過(guò)改良MS培養(yǎng)基，添加6-BA 0.4 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1，蔗糖3%，瓊脂4.0-5.0 g?L-1，pH值5.8 ~ 6.2，并根據(jù)繼代苗生長(zhǎng)情況調(diào)整6-BA和NAA的濃度。

1.2.3.2 深化試驗(yàn)

對(duì)于預(yù)備試驗(yàn)培育后生長(zhǎng)不理想的無(wú)性系，選用改良ER(微量元素用MS的量)，WPM做基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加6-BA、NAA和KT，改變光照條件，接種后先暗培養(yǎng)10 d，試驗(yàn)材料作幼化處理等。

1.2.3.3 增殖倍數(shù)的確定方法

因?yàn)槔^代培養(yǎng)的芽苗大小不一致，各代芽苗數(shù)出現(xiàn)重疊，用切割芽苗數(shù)來(lái)計(jì)算，理論上比較準(zhǔn)確，但在實(shí)際中難以操作。所以采用連續(xù)繼代培養(yǎng)3代，以最后一次繼代苗瓶數(shù)和起始瓶數(shù)，按=3計(jì)算增殖倍數(shù)。為最后一次繼代苗瓶數(shù)；為初始繼代苗瓶數(shù)；為增殖系數(shù)。要求接種時(shí)每瓶芽苗數(shù)盡量一致。

1.2.4 生根培養(yǎng)

1.2.4.1 預(yù)備試驗(yàn)

剪切1.2 ~ 1.5 cm長(zhǎng)的單芽，接種到生根培養(yǎng)基1/2改良MS + NAA 1.0 mg?L-1+ IBA 0.5 mg?L-1，蔗糖3%，瓊脂4.0 ~ 5.0 g?L-1，pH值5.8 ~ 6.2，每個(gè)無(wú)性系接種40瓶，每瓶10株。

1.2.4.2 深化試驗(yàn)

選用B2(廣西欽州市林科所研制)、1/2改良ER、1/2改良MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加ABT1、IBA作為生根激素，按照生根率和出根特征，調(diào)整激素濃度，再添加根太陽(yáng)(一種分子信號(hào)促生根物質(zhì))進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 大花序桉離體培養(yǎng)和植株再生的培養(yǎng)條件

1.2.5.1 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)室溫度26 ± 2℃，生根苗在大棚煉苗時(shí)溫度18 ~ 35℃。

1.2.5.2 光照條件

繼代培養(yǎng)以自然散射光為主，每天光照時(shí)間為10 ~ 12 h，光照強(qiáng)度1 500 ~ 2 000 lux，剛接種時(shí)弱光條件下培養(yǎng)，隨后逐步增強(qiáng)。自然光照不足時(shí)，用人工光源補(bǔ)足。生根培養(yǎng)中，光照也由弱光條件向強(qiáng)光條件遞增。大棚煉苗時(shí)，光照強(qiáng)度1 500 ~ 7 000 lux。

1.2.6 生根甁苗移栽

1.2.6.1 煉苗和洗苗方法

開(kāi)蓋后，灌注冷開(kāi)水到培養(yǎng)基再煉苗。洗苗時(shí)，將培養(yǎng)基放入水中捏碎，取出苗根。

1.2.6.2 栽培基質(zhì)的選擇

①育苗用輕型基質(zhì)，椰糠+泥炭土(5:3)；②黃心土+蛭石(5:1)；③輕基質(zhì)(椰糠+泥炭土)+黃心土(3:1)?；|(zhì)在移栽前2 d，用0.3%高錳酸鉀溶液消毒。

1.2.7 大花序桉組培苗造林試驗(yàn)

1.2.7.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選大花序桉組培無(wú)性系苗CL1造林，用大花序桉實(shí)生苗作對(duì)照，株行距2 m × 4 m，寬行窄株布置。以組培苗3行，實(shí)生苗3行交替塊狀種植，機(jī)耕全墾整地。

1.2.7.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)調(diào)查

造林2個(gè)月后調(diào)查統(tǒng)計(jì)成活率，造林1 a后調(diào)查測(cè)定樹(shù)高和胸徑，觀測(cè)記錄幼樹(shù)形態(tài)和干形，每年測(cè)定樹(shù)高胸徑1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)樹(shù)萌芽處理的效果

2.1.1 優(yōu)樹(shù)萌芽形態(tài)特征觀察與分類(lèi)

對(duì)優(yōu)樹(shù)萌芽觀察后表明，砍伐的優(yōu)樹(shù)都具有萌芽能力。萌芽條具有區(qū)別于尾巨桉等其他桉樹(shù)的固有特征，各優(yōu)樹(shù)間又有明顯的差異。結(jié)合觀察間伐的大量大花序桉萌芽形態(tài)特征，大致可劃分分為3類(lèi)。由表1可知，大花序桉萌芽形態(tài)差異大，表明各優(yōu)樹(shù)之間基因性狀的差異也大，這為在群體中選擇到相對(duì)易于繁殖的個(gè)體提供了依據(jù)。進(jìn)行分類(lèi)組培研究，有可能獲得通過(guò)觀察萌芽特征，初步判斷繁殖能力大小的方法。

表1 大花序桉優(yōu)樹(shù)萌芽形態(tài)特征及分類(lèi)

2.1.2 外植體選擇與滅菌方法對(duì)無(wú)菌芽誘導(dǎo)的影響

按照外植體在萌芽條上節(jié)位的高低和木質(zhì)化程度，分為3類(lèi):A、萌條上部，僅含有芽點(diǎn)或小側(cè)芽的嫩莖段；B、萌條中段，已萌發(fā)較長(zhǎng)側(cè)芽的半木質(zhì)化莖段；C、萌條中下部，已萌發(fā)較長(zhǎng)側(cè)芽的木質(zhì)化莖段。依據(jù)萌條木質(zhì)化程度采用相應(yīng)的消毒滅菌時(shí)間，統(tǒng)計(jì)多次消毒滅菌后12 d的檢查結(jié)果。表2顯示，含有芽點(diǎn)或小側(cè)芽的A類(lèi)外植體，因?yàn)樘?，木質(zhì)化程度低，經(jīng)短時(shí)間消毒滅菌處理后，外植體褐化枯死率高，而且萌芽質(zhì)量不理想。C類(lèi)外植體比較老，接種后污染率偏高，莖切口處培養(yǎng)基褐化比較重，萌芽質(zhì)量差。B類(lèi)外植體褐化、污染率較低，相對(duì)比較易萌芽，萌芽質(zhì)量比較好，是大花序桉誘導(dǎo)無(wú)菌芽宜選用的外植體，但第一批側(cè)芽已經(jīng)萌發(fā)，并在消毒滅菌前已修剪，外植體萌發(fā)的是第二批潛伏芽。這與尾巨桉有一定差別，也增加了無(wú)菌芽誘導(dǎo)的難度。

表2 大花序桉不同類(lèi)型外植體消毒滅菌情況表

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響

選用半木質(zhì)化莖段B類(lèi)外植體接種，除去污染、褐化枯死者，以接種后36 d為界。累積多次外植體誘導(dǎo)無(wú)菌芽的調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果，得出各類(lèi)優(yōu)樹(shù)萌芽情況。從表3可知，不同類(lèi)型優(yōu)樹(shù)的外植體其萌生無(wú)菌芽存在較大差異。Ⅱ類(lèi)易萌生叢芽，Ⅲ類(lèi)萌生的無(wú)菌芽節(jié)間太短，僅見(jiàn)葉不見(jiàn)莖，幾乎成無(wú)效芽。Ⅰ類(lèi)芽少，節(jié)間長(zhǎng)。體現(xiàn)了優(yōu)樹(shù)萌芽的特征，即伐樁芽多，外植體萌芽也多。

為改善第Ⅲ類(lèi)優(yōu)樹(shù)外植體萌芽的不足，調(diào)整了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與配比，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)劑改為改良MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.5 mg?L-1；雖然結(jié)果表明總的萌芽數(shù)仍然少，但提高了無(wú)菌芽質(zhì)量，節(jié)間伸長(zhǎng)，有效芽數(shù)增加。所以，針對(duì)不同伐樁的萌芽特征，需選擇相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。Ⅲ類(lèi)優(yōu)樹(shù)萌芽作外植體誘導(dǎo)無(wú)菌芽，宜選用細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比值較低的培養(yǎng)基，以6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.5 mg?L-1較合適。

表3 各類(lèi)型大花序桉優(yōu)樹(shù)外植體萌發(fā)無(wú)菌芽情況

2.3 增殖培養(yǎng)基對(duì)叢芽增殖和繼代培養(yǎng)的影響

2.3.1 預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果

從未污染外植體上切取無(wú)菌芽，第一代轉(zhuǎn)接時(shí)需連帶一小段母枝，利于無(wú)菌芽生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基后，萌芽逐漸增多，形成側(cè)芽和腋芽共同增殖的態(tài)勢(shì)。表4顯示，3類(lèi)不同的原材料形成的繼代芽苗外觀形態(tài)差異明顯。瓶苗的生長(zhǎng)情況反映了伐樁萌芽的生長(zhǎng)特點(diǎn)。伐樁萌芽多，生長(zhǎng)旺盛者，組培繁育后也表現(xiàn)增殖多，生長(zhǎng)旺盛，具有基因依賴(lài)性。

表4 各類(lèi)大花序桉優(yōu)樹(shù)無(wú)菌芽繼代增殖情況

不斷繼代培養(yǎng)，Ⅰ類(lèi)材料保持穩(wěn)定的增殖，因?yàn)榧に卦谥参矬w內(nèi)的積累，芽苗逐漸增多，增殖系數(shù)有一定提高，五代之后，處于穩(wěn)定狀態(tài)。Ⅱ類(lèi)材料保持高增殖狀態(tài)，五代之后叢生芽過(guò)多，處于團(tuán)芽中間部分的芽苗變得細(xì)弱，需要降低激素濃度與比值，用6-BA 0.2 mg?L-1+NAA 0.1 mg?L-1。結(jié)果向人為需要的方向發(fā)展，反應(yīng)較靈敏。當(dāng)需要接種生根時(shí)，對(duì)于增殖系數(shù)過(guò)高，芽苗細(xì)弱者，還需要作一次壯苗培養(yǎng)，才有利于生根。Ⅰ、Ⅱ類(lèi)材料適合在預(yù)備試驗(yàn)的增殖培養(yǎng)基上。Ⅲ類(lèi)材料則表現(xiàn)出增殖系數(shù)低，芽苗節(jié)間難伸長(zhǎng)，苗高1.5 cm以下，葉片大，在單位面積的培養(yǎng)基上芽苗數(shù)量太少等問(wèn)題，需要作進(jìn)一步深化試驗(yàn)。

2.3.2 深化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.1 改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基和激素濃度

表5的數(shù)據(jù)表明，改良MS培養(yǎng)基，調(diào)高6-BA/NAA的比值，Ⅲ類(lèi)材料的側(cè)芽增多，但芽苗短小，如未開(kāi)的桃花著生在葉腋處，多數(shù)是無(wú)效芽。需要用6-BA和NAA濃度比值為1的壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)，芽苗的莖節(jié)間才伸長(zhǎng)，而且高生長(zhǎng)仍有限，低于1.5 cm。繼續(xù)往下培養(yǎng)，出現(xiàn)側(cè)芽少，增殖系數(shù)不足1.5，苗高葉達(dá)不到要求。改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基，改良ER與改良MS的差異不明顯，用WPM培養(yǎng)基，芽苗生長(zhǎng)表現(xiàn)不如改良MS，芽苗增殖有限，難以拔節(jié)長(zhǎng)高。以改良MS作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加KT 0.2mg?L-1，芽苗有一定的高生長(zhǎng)，側(cè)芽也有伸長(zhǎng)，拔節(jié)作用較為明顯，但很少見(jiàn)有叢生芽，仍以側(cè)芽增殖為主。

表5 3類(lèi)大花序桉優(yōu)樹(shù)無(wú)菌芽繼代增殖情況

2.3.2.2 改變光照條件以促進(jìn)苗高生長(zhǎng)

接種繼代后，在繼代初期實(shí)行全暗培養(yǎng)，在7 ~ 12 d內(nèi)，芽苗新生芽白化，稍有伸長(zhǎng)，老葉仍綠，但部分老葉黑化死亡，包括部分嫩梢黑化死亡，總的比率達(dá)到20%；見(jiàn)光培養(yǎng)后，維持原狀，高生長(zhǎng)不顯著。接種繼代后，用日光燈作光源，四周遮光，光線從頂部照射，利用植物的向光性促進(jìn)拔節(jié)伸長(zhǎng)。其結(jié)果亦不理想，高生長(zhǎng)有限，而且苗木生長(zhǎng)勢(shì)比較弱。部分葉片黑化死亡，原因不知。

2.3.2.3 進(jìn)行幼化處理促進(jìn)苗木生長(zhǎng)

考慮到優(yōu)樹(shù)樹(shù)齡大，萌條位置雖然是在根莖附近，但需要作幼化處理，以解除原材料對(duì)無(wú)菌芽的束縛。切取芽苗莖尖，長(zhǎng)度0.5 cm作繼代培養(yǎng)。結(jié)果新芽仍不能長(zhǎng)高，增殖也同原來(lái)一樣，葉片圓形，葉片與莖的夾角比較大，只是葉片變小了一些。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅲ類(lèi)材料增殖不夠和苗高有限的特點(diǎn)，具有基因依賴(lài)性，對(duì)外部條件改善難以奏效。針對(duì)沒(méi)有叢芽、僅有側(cè)芽，而且節(jié)間不伸長(zhǎng)的特點(diǎn)，采用無(wú)菌短枝型分化方式[5]，將繼代芽切成帶側(cè)芽的小段，轉(zhuǎn)接到含有KT的改良MS培養(yǎng)基，通過(guò)不斷調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例以及濃度，經(jīng)反復(fù)多次培養(yǎng)之后，苗木增殖和苗高生長(zhǎng)都得到改善，增殖系數(shù)達(dá)到2.5倍，苗高達(dá)到1.5 ~ 2.0 cm，能反復(fù)繼代培養(yǎng)，結(jié)果比較穩(wěn)定，芽苗為有效芽，能進(jìn)行批量生產(chǎn)組培苗，規(guī)模生產(chǎn)組培苗的方案是先利用較高細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度比例的培養(yǎng)基，形成較多數(shù)量的芽點(diǎn)，再用較低比例的培養(yǎng)基讓小芽伸長(zhǎng)，這樣做會(huì)使培養(yǎng)周期延長(zhǎng)，但能夠達(dá)到一定的增殖系數(shù)并產(chǎn)生有效芽，進(jìn)入批量生產(chǎn)，從而解決這類(lèi)材料的快繁問(wèn)題。實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，與KT的使用有關(guān)，單純用6-BA，莖節(jié)間難以伸長(zhǎng)，另一個(gè)原因可能是經(jīng)多代培養(yǎng)后，芽苗內(nèi)源激素與外源激素逐漸平衡有關(guān)。

2.4 生根培養(yǎng)基對(duì)大花序桉生根的影響

2.4.1 預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，芽苗生長(zhǎng)穩(wěn)定之后，選取健壯的單芽切割，接種到預(yù)備試驗(yàn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 d后，調(diào)查生根情況，結(jié)果見(jiàn)表6。初步試驗(yàn)結(jié)果顯示，大花序桉Ⅱ、Ⅲ類(lèi)材料，有少許出根，相對(duì)Ⅰ類(lèi)材料易于生根，但與尾巨桉DH32-29相比，生根率很低，而且根系質(zhì)量與苗的質(zhì)量都遠(yuǎn)不如尾巨桉。大花序桉不同品系之間，差異比較明顯。Ⅰ類(lèi)材料，易形成類(lèi)根組織且比較突出。類(lèi)根組織外形上與根相似，易與真根混淆，其主要特征：長(zhǎng)0.3 ~ 1.0 cm，圓柱形，表面光滑，無(wú)根毛，無(wú)側(cè)根，但有分叉。當(dāng)激素濃度較高時(shí)，形成鹿角狀類(lèi)根組織，與愈傷團(tuán)有差別。移栽到育苗基質(zhì)后，成活率在5%以下。在預(yù)備培養(yǎng)基上，Ⅰ類(lèi)材料未生根，Ⅱ、Ⅲ類(lèi)材料生根率很低，離規(guī)模生產(chǎn)要求差距較大。

表6 三種大花序桉在預(yù)備生根培養(yǎng)基的生根情況

2.4.2 深化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2.1 生根劑的調(diào)試

以1/2改良MS培養(yǎng)基和ABT1促根劑的配合，利于大花序桉產(chǎn)生真根。其根比較細(xì)長(zhǎng)，但結(jié)實(shí)，苗的主干也變得結(jié)實(shí)，葉片更綠。單因子多濃度梯度試驗(yàn)，以0.2 mg?L-1為一個(gè)梯度，濃度范圍0.3 ~ 3.0 mg?L-1。結(jié)果表明，ABT10.5 mg?L-1以下，沒(méi)有根出現(xiàn)，莖切口處無(wú)反應(yīng)；當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg?L-1時(shí)，切口處愈傷特別大，葉片碰到培養(yǎng)基時(shí)，也形成愈傷組織或類(lèi)根組織。用ABT1促根，濃度應(yīng)選擇在0.5 ~ 2.5 mg?L-1之間，多次對(duì)不同無(wú)性系調(diào)試試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)后，以1.0 ~ 1.5 mg?L-1有比較好的出根率，Ⅱ、Ⅲ類(lèi)材料出根率高于Ⅰ類(lèi)材料，Ⅱ類(lèi)材料出根率最高，超過(guò)60%。

再用ABT1和IBA協(xié)同促生根處理，按新配方多濃度配制培養(yǎng)基，接種后最佳處理表現(xiàn)為莖切口微膨大，出根條數(shù)增加，每株出3 ~ 5條真根。Ⅰ類(lèi)材料有15%的出根率，Ⅲ類(lèi)材料出根率上升至78.5%。主要原因是ABT1和IBA組合，充分發(fā)揮了互補(bǔ)作用。ABT1主要成分是吲哚乙酸(IAA)和萘乙酸(NAA)，關(guān)鍵成分是新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。ABT1的生理活性與NAA、IBA等調(diào)節(jié)不同，它具有通過(guò)強(qiáng)化調(diào)控植物內(nèi)源激素含量和重要酶的活性，促進(jìn)生物分子合成的作用，誘導(dǎo)植物不定根的形態(tài)建成[6]。IBA促根作用強(qiáng)，但在植物體內(nèi)移動(dòng)性比較差，所以用生理活性強(qiáng)的ABT1和低濃度的IBA配合，具有相互促進(jìn)與互補(bǔ)功效，當(dāng)濃度使用得當(dāng)，就產(chǎn)生好的生根效果。

2.4.2.2 新型生根劑的應(yīng)用

在ABT1和IBA協(xié)同作用下，生根率大幅提升，但芽苗切口有一定的愈傷組織，部分生根和愈傷組織相距很近，當(dāng)愈傷組織在洗苗時(shí)發(fā)生脫落，那么根在受到外力碰撞時(shí)，也易于脫落。為解決這一不足，添加新型生根劑—根太陽(yáng)，取得了較好效果。

根太陽(yáng)是一種新型的分子信號(hào)誘導(dǎo)生根劑，它可以通過(guò)誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)根原基發(fā)出新根。在大花序桉誘導(dǎo)生根過(guò)程中，有一典型特征就是誘導(dǎo)莖的皮層發(fā)根，離莖切口比較遠(yuǎn)。這類(lèi)根在洗苗時(shí)不易脫落，移栽成活率較高，只要濃度應(yīng)用得當(dāng)，效果明顯。

2.4.2.3 改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基

選?、箢?lèi)材料的健壯芽苗，每瓶接15株，每個(gè)處理共接20瓶，接種到B2、1/2改良ER、1/2改良MS培養(yǎng)基，添加ABT1和IBA，其生根情況如表7。B2培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是根細(xì)而結(jié)實(shí)，但顯著的缺點(diǎn)就是苗高生長(zhǎng)不足。1/2改良ER與1/2改良MS差異不大，苗能夠長(zhǎng)高，但木質(zhì)化不夠，根系虛大。在B2和1/2改良MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度水平上，調(diào)整部分礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)濃度，特別是NH4+的含量，結(jié)果取得較好的效果，出根率提高，苗高達(dá)到2.0 cm以上，根系比較結(jié)實(shí)。再經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)和激素濃度的配合調(diào)試，最終形成大花序桉生根培養(yǎng)基：1/2改良MS+ABT1+IBA+根太陽(yáng)。

表7 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生根情況

2.4.3 馴化作用對(duì)生根的影響

隨著大花序桉無(wú)菌芽繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，切取健壯芽苗接種到相同配方的生根培養(yǎng)基上，生根率和根的條數(shù)都有逐步提高的趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表8。生根的馴化作用，可能來(lái)源于繼代苗的馴化。隨著繼代次數(shù)的增加，芽苗生長(zhǎng)穩(wěn)定，而且對(duì)培養(yǎng)基成分變化的緩沖作用增強(qiáng)了，苗木生長(zhǎng)整齊，大小一致，只是在生根培養(yǎng)基中表現(xiàn)突出，易于觀測(cè)。在繼代初期，選取規(guī)格一致的優(yōu)勢(shì)芽苗接種生根，生根率很低，到45代之后，即誘導(dǎo)無(wú)菌芽，繼代培養(yǎng)后2 a時(shí)間，生根率提高，出根條數(shù)增加，其中表現(xiàn)較好的CL1號(hào)的平均生根率達(dá)到88.9%，出根數(shù)3 ~ 5條，苗高生長(zhǎng)也達(dá)到要求。在不同無(wú)性系之間，馴化作用的表現(xiàn)又有差異，Ⅰ類(lèi)材料在繼代多代之后，生根率提高的幅度仍然有限，沒(méi)有達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)的要求。

表8 大花序桉CL1隨著繼代次數(shù)增加生根情況統(tǒng)計(jì)表

2.5 大花序桉生根苗移栽

2.5.1 煉苗洗苗方法對(duì)移苗質(zhì)量的影響

移栽前通過(guò)揭開(kāi)瓶蓋，降低瓶?jī)?nèi)濕度，有利于增強(qiáng)小苗葉片革質(zhì)化，減小蒸騰對(duì)水分的消耗，增強(qiáng)小苗對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)能力，大花序桉開(kāi)蓋煉苗后，出現(xiàn)葉片萎焉現(xiàn)象，移栽后成活率降低?？紤]到因?yàn)檎趄v作用強(qiáng)，吸干培養(yǎng)基原有水分，加注自來(lái)水，然后再煉苗，結(jié)果培養(yǎng)基污染嚴(yán)重，這表明培養(yǎng)基中還有較多糖和其他有機(jī)物未吸收利用完，容易滋生細(xì)菌。因此只能加冷開(kāi)水，煉苗2 d。

在洗苗去除培養(yǎng)基時(shí)，很容易斷根，按照洗尾巨桉的方法，一手拿苗，一手捏碎培養(yǎng)基，再向上提苗的步驟，斷根約30%以上，驗(yàn)收生根率達(dá)到90%的甁苗，洗苗移栽后僅剩60%左右。所以必須一手拿苗，一手托住培養(yǎng)基，放在水中捏碎培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)，將培養(yǎng)基去掉，雖然這樣比較費(fèi)時(shí)，但根系保存完整，移苗后成活率高。

2.5.2 基質(zhì)對(duì)大花序桉移栽的影響

在春季，移栽后45 d，檢查苗木成活率和生長(zhǎng)情況(表9)。

輕基質(zhì)移栽后易出現(xiàn)苗木枯死且較多，黃心土作基質(zhì)成活率高，但是生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不佳。輕基質(zhì)+黃心土是最好基質(zhì)，苗木易成活，生長(zhǎng)也好。說(shuō)明黃心土和輕基質(zhì)對(duì)大花序桉根的生長(zhǎng)影響比較大，原因可能在于土壤膠體貯存水分，易于被根系吸收，輕基質(zhì)提供部分養(yǎng)料加上空隙大，能夠提供氧氣，而桉樹(shù)生根過(guò)程中需要大量的氧氣[7]。

2.5.3 生理性立枯病對(duì)大花序桉移栽的影響

小苗移栽后，前期用薄膜覆蓋保濕，或者僅蓋上遮陰網(wǎng)。在晴朗干燥的天氣，小苗大面積干枯死亡，大花序桉實(shí)生苗也出現(xiàn)類(lèi)似的情況，外觀癥狀與立枯病十分相似。苗高5 ~ 8 cm的大苗也有立枯現(xiàn)象。采用殺菌劑無(wú)效，而且基質(zhì)本身已嚴(yán)格消毒處理，深入檢查發(fā)現(xiàn)，死亡植株沒(méi)有病原物，干枯死亡系生理性失水，采取葉面補(bǔ)水措施后，癥狀緩解，死亡株數(shù)減少。提前采取補(bǔ)水措施，立枯病癥狀可以控制或者不發(fā)生。原因可能是大花序桉小苗葉面積大，蒸騰作用過(guò)強(qiáng)和根系吸水和輸水功能障礙引起，導(dǎo)致水分虧缺。在實(shí)際生產(chǎn)中，為防止生理性立枯危害，移栽小苗生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將小苗連同無(wú)紡布基質(zhì)杯植入直徑12 cm的黃心土基質(zhì)杯中，即可減少生理性立枯病的發(fā)生。此外，病理性立枯病對(duì)大花序桉組培苗移栽危害也比較嚴(yán)重,是一種土壤中病原菌侵染引發(fā)的病害，表現(xiàn)為幼苗植株基部腐爛、矮化、黃化，用手拔植株時(shí)根部易斷，多發(fā)生在春末夏初，空氣潮濕的天氣，采用精甲?噁霉靈水劑或噁霉靈水劑進(jìn)行灌根或噴施防治，有較好的效果。

2.5.4 蟲(chóng)害防治

用輕基質(zhì)移栽小苗后，發(fā)現(xiàn)一種蟲(chóng)害癥狀：前1 d苗木生長(zhǎng)正常，第2 d出現(xiàn)萎焉死亡，不倒伏。當(dāng)拔苗出來(lái)觀測(cè)時(shí)，見(jiàn)苗莖與根部斷開(kāi)，而且斷裂處有缺口，夜間觀測(cè)，可看到白色蠕蟲(chóng)啃食苗莖。經(jīng)查證，這是尖眼蕈蚊的幼蟲(chóng)為害，其成蟲(chóng)俗稱(chēng)“小黑飛”。蟲(chóng)源可能來(lái)自輕基質(zhì)原料中的泥炭土，成蟲(chóng)產(chǎn)卵其中，在育苗大棚內(nèi)濕熱環(huán)境中孵化，幼蟲(chóng)啃食小苗。另一個(gè)原因是大花序桉幼苗莖稈肥嫩，易被蠕蟲(chóng)啃食，同時(shí)移栽的尾巨桉小苗鮮見(jiàn)受害。防治措施：①用黑光燈誘殺成蟲(chóng)，在大棚內(nèi)懸掛殺蟲(chóng)燈誘殺已孵化的成蟲(chóng)。②用殺蟲(chóng)劑毒殺幼蟲(chóng)。在移栽的育苗杯基質(zhì)表面，撒上長(zhǎng)制緩釋藥肥顆粒，毒殺幼蟲(chóng)。兩種措施配合使用，效果顯著，蟲(chóng)害得到有效控制。

2.6 大花序桉組培苗造林

2.6.1 造林成活率

選擇大雨后，林地充分濕透后造林，如果雨量不夠，種植后用人工灌水補(bǔ)足，使土壤濕潤(rùn)，造林20 d后檢查成活率98%以上，偶有死株，需及時(shí)補(bǔ)植。大花序桉組培苗葉面積較大，蒸騰作用強(qiáng)，種植難度比較大，有條件可以采用保水劑，每株0.5 ~ 1.0 kg，效果更好，只要造林措施得當(dāng)，成活率高。

2.6.2 早期生長(zhǎng)量調(diào)查結(jié)果

造林14個(gè)月后測(cè)定胸徑和樹(shù)高，以實(shí)生苗作對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 大花序桉組培苗和實(shí)生苗林分生長(zhǎng)情況表

從表10可知，大花序桉組培苗林分胸徑和樹(shù)高平均值為5.18 cm和5.31 m，而大花序桉實(shí)生苗林分胸徑和樹(shù)高平均值為4.17 cm和3.91 m，通過(guò)胸徑和樹(shù)高的極差和變異系數(shù)分析，大花序桉組培苗林分比實(shí)生苗林分在生長(zhǎng)量、整齊度方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。原因是組培苗有優(yōu)樹(shù)無(wú)性繁殖成苗，具有好的基因優(yōu)勢(shì)并且基因相同，所以苗木生長(zhǎng)快而且整齊一致，實(shí)生苗來(lái)源于不同基因的個(gè)體，生長(zhǎng)量大小不一致，出現(xiàn)分化。

2.6.3 幼林形態(tài)觀察

2.6.3.1 林相整齊，樹(shù)體大小一致

組培無(wú)性系林分，通過(guò)肉眼觀察，生長(zhǎng)整齊，樹(shù)高相差很小，樹(shù)體大小一致，表現(xiàn)了無(wú)性系林分的特征；而實(shí)生苗林分，則已表現(xiàn)出分化趨勢(shì)，主要在樹(shù)體大小的差異比較明顯，冠幅的大小，樹(shù)高都有差異，總體參差不齊。

2.6.3.2 各植株形態(tài)正常，干形好

逐株觀察，組培苗植株呈尖塔形，主干明顯，枝條分布均勻，沒(méi)有出現(xiàn)畸形植株，而實(shí)生苗林分出現(xiàn)部分干形不良植株，表現(xiàn)在1.8 ~ 2.0 m處出現(xiàn)叢生枝，形成沒(méi)有主干的狀況，近地面主干生長(zhǎng)碩大，另外還見(jiàn)到少量樹(shù)高和胸徑生長(zhǎng)量很小的植株。

2.6.3.3 枝條多，自然整枝慢

這是組培苗和實(shí)生苗共有的形態(tài)特征，基部枝條多，枝條比較長(zhǎng)，易受臺(tái)風(fēng)影響造成風(fēng)倒。對(duì)于臺(tái)風(fēng)影響頻繁的地區(qū)，需要人工整枝。

從幼林形態(tài)觀察，大花序桉組培苗表現(xiàn)出大花序桉固有的形態(tài)特征，無(wú)生長(zhǎng)畸形株，林相整齊，干形好，保持了優(yōu)樹(shù)原株的優(yōu)良特性。

3 結(jié)論與討論

大花序桉不同種源/家系的優(yōu)樹(shù)，萌芽形態(tài)差異比較大，按照芽條形態(tài)特征分類(lèi)，各類(lèi)材料在誘導(dǎo)無(wú)菌芽、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等方面都表現(xiàn)了一定的差異。特別在生根性狀上，有較多的基因依懶性。按照不同類(lèi)型的萌芽，有針對(duì)性的選擇材料繁殖，有利于組培繁育獲得成功。

大花序桉萌芽條的側(cè)芽萌生快，頂端優(yōu)勢(shì)比較弱，誘導(dǎo)無(wú)菌芽時(shí)，只能依靠第二批潛伏芽獲得無(wú)菌繁殖體系。因此，需要選育細(xì)胞分裂素濃度和生長(zhǎng)素濃度比值較低的培養(yǎng)基，有利于無(wú)菌芽的萌發(fā)。

繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)材料易于建立繼代增殖體系，芽苗增殖系數(shù)高，生長(zhǎng)質(zhì)量好。Ⅲ類(lèi)材料鮮有見(jiàn)叢生芽，增殖系數(shù)小，葉片大，苗高生長(zhǎng)不足。通過(guò)添加激動(dòng)素KT，按照無(wú)菌短枝型方式，以側(cè)芽增殖，可以達(dá)到規(guī)模生產(chǎn)的要求。

生根培養(yǎng)中，大花序桉普遍表現(xiàn)生根困難，組培快繁的瓶頸在生根環(huán)節(jié)，這是由大花序桉本質(zhì)特性決定的。大花序桉組培快繁能否進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn)，繁殖材料的基因類(lèi)型起決定作用，通過(guò)外源激素促進(jìn)生根起輔助作用，根太陽(yáng)這一新型分子信號(hào)促根劑具有一定的促生根作用。所以，選擇易于繁殖的無(wú)性系，調(diào)試合適的培養(yǎng)基，是目前大花序桉組培快繁的實(shí)用選擇。

大花序桉組培苗移栽也比較困難，主要是受到立枯病的危害。這是大花序桉特有的生理性病害。實(shí)生苗也有發(fā)生，導(dǎo)致育苗損失嚴(yán)重。原因在于葉片蒸騰作用過(guò)強(qiáng)和根系吸水障礙引起，解決辦法就是保濕。采用噴霧狀水和使用較大的育苗杯，使根系擴(kuò)大，很好地解決了這一難題。移栽大花序桉的育苗基質(zhì)，采用輕基質(zhì)和黃心土按3:1比例混合，有利于小苗成活和生長(zhǎng)。但目前在制作育苗杯/袋時(shí)，不能夠機(jī)械化作業(yè)，需要人工裝填基質(zhì)，增加了育苗成本，當(dāng)大規(guī)模生產(chǎn)大花序桉組培苗之際，應(yīng)定制專(zhuān)門(mén)的機(jī)械來(lái)制杯。

大花序桉組培苗造林后，表現(xiàn)出無(wú)性系造林的優(yōu)勢(shì)，林相整齊，能保持優(yōu)樹(shù)的良好特性，生長(zhǎng)快、干形好、無(wú)分化。無(wú)性系造林是大花序桉下一步發(fā)展的方向。通過(guò)側(cè)芽和頂芽形成以芽繁芽的組培快繁方式，沒(méi)有經(jīng)過(guò)愈傷組織途徑，無(wú)脫分化過(guò)程，獲得的再生植株遺傳性狀穩(wěn)定[8]，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模造林是可靠、安全的。

大花序桉組培快繁是可行的，培養(yǎng)技術(shù)在不斷完善，生根率不斷提高，但大花序桉難生根這一特性沒(méi)有改變。在同一培養(yǎng)基中，接種相同質(zhì)量的芽苗，結(jié)果有出根和不出根的，生根情況差異大。再加上移栽環(huán)節(jié)對(duì)技術(shù)要求高，要實(shí)現(xiàn)大花序桉組培苗無(wú)性系造林，需要提高技術(shù)水平，還要提高管理水平，做到產(chǎn)量規(guī)模化，操作專(zhuān)業(yè)化，管理精細(xì)化。

本研究中Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)優(yōu)樹(shù)已有無(wú)性系進(jìn)入規(guī)模生產(chǎn)組培苗，兩個(gè)無(wú)性系已累計(jì)生產(chǎn)組培苗10萬(wàn)株，出圃造林累計(jì)近70 hm2，用于推廣試驗(yàn)。Ⅰ類(lèi)優(yōu)樹(shù)因?yàn)樯瘦^低，多數(shù)是類(lèi)根組織，需要繼續(xù)研究，提高生根率才能實(shí)現(xiàn)無(wú)性系造林。下一步需要繼續(xù)改進(jìn)和完善Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)材料培養(yǎng)基配方，探索環(huán)境條件對(duì)組培繁育的影響，不斷提高苗木質(zhì)量，降低育苗成本。繼續(xù)探索Ⅰ類(lèi)材料的促根技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)每一株優(yōu)樹(shù)都能夠繁育成無(wú)性系造林的目標(biāo)。

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Tissue Culture Techniques forandField Evaluation Resultant Clones

TANG Zaisheng, WANG Jianzhong, MO Jiyou, XIONG Tao, ZHANG Lei, LI Lifang, LAN Jun

(,,)

Buds from 16 to 30 year old elite trees ofwere used to study aspects of tissue culture propagation of clones of these trees, including: sterile bud induction, cluster bud proliferation, successive transfer culture,rooting, transplanting into nursery growing tubes and early field establishment. In this study suitable tissue culture media for growth ofwas identified along with protocols necessary for rapidtissue culture propagation, starting from buds collected off the original trees. These protocols, along with methods developed for subsequent nursery culture, can provide for rapid propagation ofelite trees and are suited to the needs of large-scale production to service plantation establishment programs. The rooting rate of the clone CL1 reached 88.9%, transplanting survival rate reached 82.7% and initial test production yielded one hundred thousand tissue culture seedlings, enough for establishment of 70 hm2of commercial plantations. Early results from field trials show that thetissue cultured clones can keep the superior traits of the original mother trees (i.e. the ortets), with the young clonal trees showing remarkably fast early growth.

; tissue culture; clonal afforestation

S722.3+7

A

廣西林業(yè)科技項(xiàng)目“大花序桉良種組培快繁技術(shù)研究”(桂林科研〔2015〕第18號(hào))。

唐再生(1972— )，男，學(xué)士，高級(jí)工程師，主要從事桉樹(shù)育種、組培育苗及優(yōu)良無(wú)性系開(kāi)發(fā)及推廣研究。

蘭俊(1981— )，男，碩士，高級(jí)工程師，主要從事桉樹(shù)遺傳改良及無(wú)性系開(kāi)發(fā)研究，E-mail：57714915@qq.com