劉果，謝耀堅(jiān)，吳志華，陳鴻鵬，彭彥

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印加果5個(gè)油體蛋白基因的表達(dá)特征及序列分析

劉果，謝耀堅(jiān)，吳志華，陳鴻鵬，彭彥

(國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

油體蛋白是植物油體結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)的最主要蛋白質(zhì)，在種子發(fā)育和脂肪酸合成及其累積中發(fā)揮重要作用。本研究利用生物信息學(xué)手段詳細(xì)解剖了印加果5個(gè)油體蛋白的序列特征，結(jié)果表明5個(gè)油體蛋白均為高度疏水的堿性小分子非分泌蛋白，存在2至3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)與保守油體蛋白功能結(jié)構(gòu)域。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了5個(gè)油體蛋白在印加果種子不同發(fā)育階段的表達(dá)變化，結(jié)果表明5個(gè)油體蛋白在印加果種子成熟階段中特異高效表達(dá)，而在種子發(fā)育初期和中期階段微弱表達(dá)。這些研究能夠?yàn)樯钊胙芯坑〖庸N子中油脂合成機(jī)理、解析油體蛋白功能提供理論基礎(chǔ)。

印加果；油體蛋白；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；序列分析

植物脂類物質(zhì)是植物種子貯藏能量最重要、最有效的方式，在開花植物的種子、花粉和根等多種器官中廣泛存在，在植物生長和發(fā)育過程中具有重要的作用[1-2]，其中脂類物質(zhì)一般以三酰甘油(Triacylglycerols, TAG)的形式存在。種子中的TAG分子之間彼此分散成許多穩(wěn)定的小的亞細(xì)胞微滴，被稱為油體(Oil Body, OB)[3]。根據(jù)TZEN等[4]提出的油體結(jié)構(gòu)模型，油體內(nèi)部為液態(tài)TAG，外部由單層磷脂分子(Phospholipids, PL)及油體蛋白(Oleosin)組成的半單元膜，這個(gè)半單元膜的基本單位是由13個(gè)PL分子和1個(gè)Oleosin分子組成。其中PL占油體表面的80%，Oleosin蛋白占20%。

Oleosin是一類特殊的鑲嵌在植物油體表面的堿性小分子貯藏蛋白，分子量為15-26 kDa，主要在油料植物種子中特異表達(dá)[5]。在芥菜()中最先發(fā)現(xiàn)油體蛋白基因的存在，目前已報(bào)道了多種植物的油體蛋白基因序列及蛋白序列，如玉米()[6]、蓖麻()[7]、芝麻()[8]、向日葵()[9]、大豆()[10]、油桐()[11]、油茶()[12]、擬南芥()[13]和油菜()[14]等，油體蛋白是油體結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)最主要的蛋白[10]，其主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體負(fù)責(zé)合成[15]。油體蛋白被認(rèn)為是酯酶與油體間的結(jié)合位點(diǎn)，在種子發(fā)芽時(shí)期到至關(guān)重要的作用，并且油體蛋白能夠在空間上阻礙油體分子間相互聚合，對維持油體的穩(wěn)定性和油體大小極為重要[16]。Oleosin蛋白在被子植物中常以基因家族的形式存在[17]。不同來源的油體蛋白均具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端兩性(兼親水性和親脂性)區(qū)、中間高度疏水區(qū)和C端α-螺旋結(jié)構(gòu)域[18]。中間疏水區(qū)存在一個(gè)由12個(gè)氨基酸組成的極為保守的脯氨酸結(jié)(Proknot，-PX5SPX3P-)，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)使油體蛋白能夠滲入到油體的磷脂單分子層中，并且油體蛋白之間可能通過該區(qū)域互相結(jié)合，在蛋白質(zhì)折疊加工過程中起至關(guān)重要的作用[19]。

印加果()，印加語稱Sacha Inchi，又稱星油藤、南美油藤、印加花生，是大戟科(Euphorbiaceae)多年生木質(zhì)藤本植物[20]。原生長在海拔200 ~ 1 700 m的南美洲安第斯(Andres)山脈地區(qū)熱帶雨林，被當(dāng)?shù)赝林用袷秤昧? 000多年[21]。印加果種子油中含有大量不飽和脂肪酸，約占脂肪含量的81.18% ~ 92.46%[22]，其中具有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病等作用的亞麻酸和用于治療高血脂和動脈硬化等癥的亞油酸二者含量高達(dá)80%以上[23-24]，同時(shí)印加果油中還含有生育酚、甾醇、多酚等脂質(zhì)活性物質(zhì)[25]，被認(rèn)為是世界上最好的植物油之一。因此，為深入研究開發(fā)和利用印加果種子油的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場潛力，本研究通過前期構(gòu)建的印加果種子不同生長時(shí)期的cDNA文庫獲得印加果油體蛋白基因的5個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對其蛋白序列進(jìn)行特征解析，并對其在不同生長時(shí)期的種子中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步揭示印加果種子油脂合成機(jī)理、油脂合成的關(guān)鍵酶基因的功能提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

印加果種子采集于廣東省湛江市遂溪縣南方國家級林木種苗示范基地的印加果種子園(N21°30′，E111°38′)，降雨量1 567 mm，年平均氣溫23.1℃，平均海拔約90 m。根據(jù)印加果種子油中各種脂肪酸含量的變化規(guī)律，對印加果種子的5個(gè)生長階段(分別為種子形成階段SI-1、種子發(fā)育初期階段SI-2、種子發(fā)育中期階段SI-3、種子發(fā)育中后期階段SI-4和種子成熟階段SI-5)進(jìn)行樣品采集。果實(shí)采摘后即刻剝?nèi)ス?，將種子置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 印加果Oleosin基因cDNA序列

根據(jù)本研究前期構(gòu)建的印加果種子5個(gè)不同生長階段的cDNA文庫，使用組裝軟件Trinity對所有短Reads進(jìn)行重新組裝，通過reads overlap關(guān)系得到不含N的44 797個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Unigene)。通過Blastx將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、SwissProt、KEGG 和 KOG(evalue<10-5)，得到跟給定 Unigene 具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該 Unigene 的蛋白功能注釋信息。根據(jù)注釋結(jié)果得到5個(gè)Oleosin基因，分別為Unigene0002468、 Unigene0004438、Unigene0020334、Unigene0010027和Unigene0035658。

1.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

將-80℃中保存的印加果種子迅速取出，去除種皮后將種仁置于液氮中快速研磨，利用TRNzol總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，純化后使用NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀和RNase free凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。每個(gè)生長階段的印加果種子設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取2μgRNA，使用FastQuant RT Kit(with gDNase)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得高質(zhì)量的cDNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

本研究將5個(gè)Oleosin基因作為驗(yàn)證基因，其qRT-PCR引物序列、Tm值以及擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小如表1所示。選用在印加果種子整個(gè)生長發(fā)育過程中穩(wěn)定表達(dá)的Actin基因(Unigene0026056)作為內(nèi)參基因，對驗(yàn)證基因的表達(dá)水平進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。20 μl實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系中cDNA模板4 μl，qPCR Master Mix 10 μl，前后向特異引物(10μM)各0.4 μl。PCR擴(kuò)增條件為95℃ 90 s預(yù)變性后，95℃變性5 s，60℃復(fù)性15 s，共40個(gè)循環(huán)，同時(shí)對實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行SYBR溶解曲線分析，并采用△△Ct(comparative cycle threshold)的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，其中△△Ct=(待測組目的基因的Ct值-待測組管家基因的Ct值)-(對照組目的基因的Ct值-對照組管家基因的Ct值)[26]。

表1 5個(gè)Oleosin基因及1個(gè)內(nèi)參基因的引物信息表

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI BlastP程序?qū)ν茖?dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索和比較；通過在線軟件線ExPASyProtParam程序分析對各種氨基酸含量、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量及穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測；根據(jù)NCBI Conserved Domain Search對蛋白功能域進(jìn)行分析；使用在線軟件Siganal V4.0、Proscale和TMHMM分別檢測蛋白質(zhì)信號肽、親水/疏水特性和跨膜結(jié)構(gòu)；利用SOPMA程序預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用在線軟件Swiss_model預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；根據(jù)利用MEGA軟件構(gòu)建最大似然法(ML, Maximum Likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 印加果5個(gè)Oleosin蛋白的序列分析

從印加果種子總cDNA文庫中獲得的Oleosin轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)可知，5個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Unigene0002468、Unigene0004438、Unigene0020334、Unigene0010027和Unigene0035658)序列長度分別為725 bp、688 bp、1 270 bp、1 271 bp和766 bp，各片段長度均大于各基因預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小，這是由于cDNA序列覆蓋了基因的非編碼區(qū)和內(nèi)含子序列。如Unigene0010027的cDNA全長1 270 bp，包括38 bp 5’末端非編碼區(qū)(5’UTR)、432 bp完整開放閱讀區(qū)、455 bp內(nèi)含子區(qū)、222 bp完整開放閱讀區(qū)和125 bp 3’末端非翻譯區(qū)(3’UTR)。

通過NCBI網(wǎng)站Blastp工具對5個(gè)印加果Oleosin蛋白進(jìn)行相似性搜索分析(圖1)，結(jié)果表明5個(gè)蛋白均包含一個(gè)的保守區(qū)域“Oleosin domin”，均屬于油質(zhì)蛋白Oleosin超家族蛋白之一。

圖1 印加果5個(gè)Oleosin蛋白序列在NCBI中Blastp分析結(jié)果

根據(jù)5條Oleosin蛋白序列及其他物種Oleosin蛋白序列的BlastP比對結(jié)果(圖2)分析發(fā)現(xiàn)，23條Oleosin蛋白序列的N端和C端氨基酸序列具有較大差異性，而中間氨基酸區(qū)域具有較高保守性，尤其是由3個(gè)脯氨酸和1個(gè)絲氨酸組成的脯氨酸結(jié)高度保守結(jié)構(gòu)域(圖中黑色框標(biāo)出)，即-PX5SPX3P-模體，為植物油體蛋白基因序列的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)特征[19]。

圖2 5個(gè)Oleosin蛋白序列與其他物種Oleosin蛋白序列的比對結(jié)果

注：1: Unigene0002468; 2: Unigene0004438; 3: Unigene0010027; 4: Unigene0020334; 5: Unigene0035658; 6: 麻瘋樹14.3kDa oleosin; 7: 橡膠樹oleosin1; 8: 麻瘋樹oleosin1; 9: 川桑oleosin1; 10: 蓖麻oleosin1; 11: 番木瓜oleosin1-like; 12: 麻瘋樹oleosin1-like; 13: 麻瘋樹oleosin3; 14: 毛果楊16.4 kDa-like oleosin; 15: 橡膠樹16.4 kDa-like oleosin; 16: 木薯16.4 kDa-like oleosin; 17: 麻瘋樹18.2kDa-like oleosin; 18: 木薯18.2kDa-like oleosin; 19: 油桐oleosin Ⅰ; 20: 印加果oleosin1; 21: 印加果oleosin2; 22: 印加果oleosin3; 23: 胡楊18.2kDa-like oleosin

通過在線軟件線ExPASyProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序分析對各種氨基酸含量、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量及穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果顯示，印加果5個(gè)Oleosin蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)值分別為29.30, 36.96, 28.74, 25.11和31.43，說明5個(gè)蛋白均屬于較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。5個(gè)Oleosin蛋白的等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量表明，印加果5個(gè)Oleosin蛋白均為堿性小分子量蛋白。根據(jù)綜合計(jì)算所得到的5個(gè)蛋白信號肽存在的可能性值可知，5個(gè)Oleosin蛋白不存在信號肽序列，均為非分泌性蛋白。

表2 5個(gè)Oleosin蛋白的理化性質(zhì)參數(shù)

蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，印加果5個(gè)Oleosin蛋白分別含有2至3個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。從圖3可知，5個(gè)Oleosin蛋白兩端均表現(xiàn)為親水性，而中間則均為一個(gè)較大的疏水區(qū)，這與油桐等植物的oleosin蛋白的分析結(jié)果一致[18]。

圖3 印加果Oleosin蛋白疏水性預(yù)測

注：Score為負(fù)值表示親水，Score為正值表示疏水。

用軟件SOPMA在線軟件對5個(gè)印加果Oleosin蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，5個(gè)Oleosin蛋白的二級結(jié)構(gòu)均由α螺旋，延伸鏈，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種狀態(tài)構(gòu)成，這與麻瘋樹油體蛋白14.3的二級結(jié)構(gòu)的組成一致[27]。5個(gè)Oleosin蛋白的N末端主要以α螺旋、β轉(zhuǎn)角為主，C端以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，中部則以延伸鏈為主。

圖4 印加果Oleosin蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2 5個(gè)Oleosin編碼基因轉(zhuǎn)錄本在印加果種子不同生長時(shí)期的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR選用在印加果種子不同生長階段中穩(wěn)定表達(dá)的Actin基因(Unigene0026056)作為內(nèi)參基因。根據(jù)5個(gè)基因的序列及其開放閱讀區(qū)(ORF)區(qū)域外側(cè)分別設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，取質(zhì)量較高的RNA為模板建立20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，獲得5個(gè)Oleosin基因在印加果種子不同生長階段樣品中的時(shí)空表達(dá)特性。

作為油體的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白，油體蛋白基因在種子發(fā)育過程中高度表達(dá)[28]。對5個(gè)Oleosin基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析的結(jié)果表明(圖5)，5個(gè)Oleosin基因均在印加果整個(gè)生長過程中表現(xiàn)為基因上調(diào)，且SI-5階段即種子成熟階段表達(dá)量非常高，而種子處于快速生長階段(SI-2和SI-3階段)的表達(dá)量則偏低。表達(dá)差異倍數(shù)分析中，以SI-1階段的表達(dá)量作為對照(表達(dá)倍數(shù)為1)，其中Unigene0010027在SI-5階段的表達(dá)倍數(shù)高達(dá)52 103.28，即該基因在SI-5階段上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量超高，而在SI-2和SI-3階段的表達(dá)倍數(shù)低至0.03，即該基因在SI-2和SI-3階段表達(dá)量偏低。

圖5 印加果種子5個(gè)Oleosin基因在不同生長階段的相對表達(dá)變化

2.3 印加果油體蛋白與其他物種的同源性分析

為探明印加果Oleosin基因與其他植物Oleosin基因間的遺傳關(guān)系，本研究對麻瘋樹、橡膠樹、川桑、蓖麻、番木瓜、毛果楊、木薯、油桐、印加果和胡楊等10種植物18條Oleosin蛋白序列進(jìn)行最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果顯示，23條Oleosin蛋白序列分為2個(gè)類群，GroupⅠ和GroupⅡ(圖6)。GroupⅠ類群包括Oleosin1、Oleosin3等14個(gè)Oleosin蛋白，其中，Unigene002468和印加果Oleosin1蛋白序列最相近，Unigene0010027和印加果Oleosin3蛋白序列相似性最高，Unigene0020334和油桐OleosinⅠ蛋白序列相似度最高。GroupⅡ類群包括Oleosin 16.4kDa-like、Oleosin 18.2kDa-like和Oleosin2等9個(gè)Oleosin蛋白，其中，Unigene0004438和印加果Oleosin2蛋白序列相似度最高，Unigene0035658和木薯Oleosin 18.2kDa-like蛋白序列相似度最高。根據(jù)蛋白序列相似度推斷，Unigene0002468為蛋白Oleosin1，Unigene0004438為蛋白Oleosin2，Unigene0010027為蛋白Oleosin3，Unigene0020334為蛋白OleosinⅠ，Unigene0035658為蛋白Oleosin 18.2kDa-like。

圖6 印加果5個(gè)Oleosin蛋白與其他植物Oleosin的同源性分析

4 結(jié)論與討論

Oleosin蛋白廣泛存在于各種植物中。這類蛋白主要存在于油體表面，對油體形成及其穩(wěn)定性具有非常重要的作用[1]，并且Oleosin基因的表達(dá)對油脂積累及脂肪酸成分有顯著的影響。本研究對印加果5個(gè)Oleosin蛋白的序列特征及在不同生長階段的表達(dá)特征進(jìn)行分析，為研究印加果種子中油脂合成機(jī)理和解析Oleosin蛋白功能提供理論基礎(chǔ)。

Oleosin蛋白為一個(gè)超家族蛋白，其基因常以基因家族形式存在。本研究對印加果5個(gè)Oleosin蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了分析和比對，并對蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽位點(diǎn)、疏水性和二級結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行了分析和預(yù)測。結(jié)果表明，印加果5個(gè)Oleosin蛋白均為高度疏水的堿性小分子蛋白，且存在2至3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，不存在信號肽剪切位點(diǎn)，均為非分泌蛋白；且5個(gè)蛋白的N末端均以α螺旋和β轉(zhuǎn)角為主，C端以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，中部則以延伸鏈為主。這與其他植物油質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)特征基因一致[17-18,27]。

本研究進(jìn)一步對5個(gè)Oleosin基因在印加果種子5個(gè)發(fā)育階段中的表達(dá)表明，5個(gè)Oleosin基因均在種子成熟階段(SI-5)超高量表達(dá)，且在種子發(fā)育初期和中期(SI-2,SI-3)的表達(dá)量偏低。根據(jù)本研究組對印加果種子發(fā)育過程中脂肪酸組分的變化分析可知，不飽和脂肪酸組分主要在種子成熟階段急劇增加，由此推斷，Oleosin基因在印加果種子成熟期的超高表達(dá)可能與不飽和脂肪酸的快速累積相關(guān)。

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Expression and Sequences Analysis on Five Sacha Inchi () Oleosin Genes

LIU Guo, XIE Yaojian, WU Zhihua, CHEN Hongpeng, PENG Yan

()

Oleosin protein, as the main structural protein of oil body, is responsible for its functional modification. Oleosin plays an important role in the process of seeds growth and fatty acid synthesis and accumulation. Five oleosin proteins in sacha inchi seeds were analyzed, using a bioinformatics method, and sequence analyses indicated that these five proteins are all highly hydrophobic, small molecular weight and non-secretory proteins. Also, they all had the same conservative functional domain with two to three types of transmembrane structure. A real-time fluorescence quantitative PCR method was employed to identify the expression mode of the genes producing these five oleosins during the growth of sacha inchi seed. The results showed that the five oleosin genes were all super expressed exclusively at the mature stage but had much lower levels of expression at the middle and late stages of sacha inchi seed development. These results help to further understand the mechanisms of fatty acid synthesis and biological functions of oleosin proteins in sacha inchi seeds.

sacha inchi; oleosin; real-time fluorescence quantitative PCR; sequence analysis

Q946.1

A

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2016QA018)。

劉果(1987— )，女，博士，助理研究員，主要從事林木分子遺傳學(xué)研究，E-mail: liuguopz@163.com.