仇汝龍 阮智楊 胡波 魏后軍 范志宇 宋艷華 陳萌萌 徐為中 王芳

摘要：為建立小反芻獸疫病毒（PPRV）、西尼羅病毒（WNV）、裂谷熱病毒（RVFV）和南非型口蹄疫病毒（SAT FMDV）的高通量 液相芯片檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank上公布的PPRV的N蛋白基因序列、WNV的E蛋白基因序列、RVFV的S片段基因序列和FMDV的5′UTR區(qū)基因序列，并基于各基因保守區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針。通過(guò)對(duì)多重PCR的上游、下游引物比例、雜交溫度、雜交時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化，并驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性和敏感性。敏感性試驗(yàn)顯示，該方法對(duì)于PPRV、WNV、RVFV以及FMDV 4種病毒最低檢出量分別為5.78×103、2.15×103、2.98×105、9.54×104 copies/μL。本研究建立的高通量液相芯片檢測(cè)方法能夠同時(shí)快速地檢測(cè)4種外來(lái)病病毒，具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查和防范外來(lái)動(dòng)物疫病具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：檢測(cè)方法;液相芯片;基因序列;條件優(yōu)化;流行病學(xué)

中圖分類號(hào)：S855.3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）13-0051-05

小反芻獸疫病毒（PPRV）、西尼羅病毒（WNV）、裂谷熱病毒（RVFV）和南非型口蹄疫病毒（SAT FMDV）是我國(guó)明確指出要重點(diǎn)防范的外來(lái)動(dòng)物疫病病毒。小反芻獸疫（peste des petits ruminants，簡(jiǎn)稱PPR）是由PPRV感染而引起的一種高度接觸性傳染病，作為外來(lái)疾病，它最早出現(xiàn)在中國(guó)西藏地區(qū)，并由西部向東部擴(kuò)散[1-2];西尼羅熱（west Nile fever，簡(jiǎn)稱WNF）是由WNV引起的一種人獸共患傳染病，該病在我國(guó)周邊國(guó)家俄羅斯、印度、巴基斯坦等國(guó)均有存在或流行，且由于其媒介昆蟲(chóng)眾多、自然宿主活動(dòng)范圍廣泛，不排除隨候鳥(niǎo)遷徙傳入我國(guó)的可能性[3];裂谷熱（rift valley fever，簡(jiǎn)稱RVF）是由RVFV引起的反芻動(dòng)物和人的一種急性、烈性傳染病，該病主要發(fā)生在非洲，但隨著我國(guó)與之貿(mào)易往來(lái)日益頻繁，裂谷熱對(duì)我國(guó)的威脅也越來(lái)越大[4];口蹄疫（foot-and-mouth disease，簡(jiǎn)稱FMD）是由FMDV引起的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患傳染病，常見(jiàn)發(fā)病于偶蹄類動(dòng)物[5]。FMDV有7個(gè)血清型，根據(jù)其同源性可將它們分為2個(gè)群，群1包括A、O、C和Asia I型，群2則包括SAT1、SAT2和SAT3。目前我國(guó)流行的為群1，但隨著國(guó)際貿(mào)易的日益頻繁，我國(guó)在進(jìn)口檢疫中亦存在SAT FMDV入侵的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，對(duì)這些疾病的診斷主要釆用血清學(xué)方法與分子生物學(xué)方法，然而傳統(tǒng)血清學(xué)檢測(cè)方法常涉及活病毒試驗(yàn)，對(duì)操作人員極易造成感染，并可能會(huì)導(dǎo)致病毒的擴(kuò)散，因此血清學(xué)方法常被非疫區(qū)國(guó)家限制使用;并且傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法也無(wú)法滿足邊境和出入境口岸的大量樣品進(jìn)行高通量檢測(cè)的需求。液相芯片技術(shù)是一種新型的生物芯片技術(shù)，并且擁有高通量、快速和準(zhǔn)確率等優(yōu)勢(shì)，很快就得到廣泛應(yīng)用，因此滿足了本研究快速高通量檢測(cè)的目的[6-7]。隨著液相芯片技術(shù)的普及，國(guó)內(nèi)外已有多種液相芯片方法建立的報(bào)道，可以針對(duì)多種重要病原微生物的檢測(cè)[8]。液相芯片檢測(cè)方法可以從血液和組織中同時(shí)檢測(cè)多種病原，擁有良好的應(yīng)用前景[9-13]。

本研究利用液相芯片技術(shù)，通過(guò)在GenBank檢索小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒共4種病毒的基因保守區(qū)域作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)4種病毒的多重PCR引物序列及相應(yīng)的探針序列。將特異性探針與微球偶聯(lián)后，與生物素化PCR產(chǎn)物雜交并與鏈親和素藻紅蛋白結(jié)合，經(jīng)懸浮芯片檢測(cè)儀來(lái)讀取中位熒光值（median florescence intensity，簡(jiǎn)稱MFI）。用建立的液相芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒，通過(guò)條件優(yōu)化后，評(píng)價(jià)其特異性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

包含PPRV保守基因序列的質(zhì)粒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存;包含RVFV、WNV、FMDV保守基因的質(zhì)粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;檢測(cè)樣品中家畜樣品部分由江蘇等地養(yǎng)殖場(chǎng)采集，部分由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病診斷中心提供;野生動(dòng)物樣品由東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院提供。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;Blood & Tissue Kits購(gòu)自QIAGEN公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司;EDC（N-（dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;MES（2[N-Morpholino] ethanesulfonic acid）、Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）、5 M TMAC（四甲基氯化銨）、10% SDS溶液、100×TE Buffer均購(gòu)自Sigma公司;鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE，streptavidin-phycoerythrin）、熒光編碼微球購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。Bio-PlexTM 200懸浮芯片系統(tǒng)由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)制造。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年11月5日至2018年5月30日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所完成，期間使用懸浮芯片檢測(cè)儀進(jìn)行的檢測(cè)在上海柏辰生物科技有限公司完成。

1.4 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的各病毒的保守區(qū)域基因序列，PPRV的N蛋白基因序列（GenBank：KX938427）、WNV的E蛋白基因序列（GenBank：GQ502441）、RVFV的S片段基因序列（GenBank：DQ380153）和FMDV南非型SAT1 5UTR區(qū)基因序列（GenBank：AY593840），利用Primer5設(shè)計(jì)出了4種病原的特異性探針，并在探針上游、下游分別設(shè)計(jì)特異性引物。分別在特異性探針的5′端進(jìn)行C12臂氨基化[NH2（CH2）12]修飾，引物及探針序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 多重PCR擴(kuò)增 將小反芻獸疫病毒、西尼羅病毒、裂谷熱病毒和南非型口蹄疫病毒的檢測(cè)引物混合，引物混合液中的每種上游引物濃度為 1.25 μmol/L，下游引物濃度為2.5 μmol/L。

以質(zhì)粒DNA為模板，按照以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：2×High Fidelity Master Mix 12.5 μL，引物混合液 1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計(jì)35循環(huán);72 ℃延伸 5 min。4 ℃保存。

1.2.2 微球與探針的偶聯(lián) 選取編碼為36#、55#、43#和27#的磁性微球分別與經(jīng)過(guò)C12臂氨基化[NH2（CH2）12]修飾的PPRV、WNV、RVFV以及FMDV探針進(jìn)行偶聯(lián)，將2支新鮮EDC粉末從4 ℃冰箱中取出于室溫靜置30 min。以最高轉(zhuǎn)速渦旋懸浮微球，并超聲30 s，使其完全分散開(kāi)。取200 μL微球加入到1.5 mL離心管中，以最高轉(zhuǎn)速離心 2 min，棄去上清，以22 μL 0.1 mol/L pH值4.5的MES重懸微球，徹底渦旋，使微球分散。在重懸的微球中加入 2 μL 對(duì)應(yīng)的探針。取恢復(fù)至室溫的EDC粉末，加入1 mL ddH2O溶解。取1.25 μL EDC溶液加入微球中，迅速渦旋混勻。黑暗中室溫孵育30 min，再次制備新鮮EDC溶液，取1.25 μL EDC溶液加入微球中，迅速渦旋混勻。黑暗中室溫孵育30 min，加入 1 mL 0.02% Tween 20，輕微渦旋混勻，以最高轉(zhuǎn)速離心2 min，棄去上清，加入0.1% SDS，重懸沉淀 40 s。以最高轉(zhuǎn)速離心2 min。棄去上清，用40 μL TE Buffer（pH值8.0）重懸沉淀。渦旋儀上以最高轉(zhuǎn)速渦旋30 s，用錫紙包裹EP管，置于 4 ℃ 黑暗條件下保存。

1.2.3 多重PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)核酸探針的微球混合物雜交 將4種病毒的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)了微球的探針進(jìn)行雜交檢測(cè)（027#-FMDV，036#-PPRV，043#-RVFV，055#-WNV）。配制工作微球混合液，在660 μL 1.5×TMAC雜交緩沖液中加入約150 000個(gè)偶聯(lián)好的微球，加入雙蒸水至終體積為990 μL，放置在冰上。將33 μL工作微球混合液加入反應(yīng)管中，并加入2 μL PCR產(chǎn)物，并用TE Buffer補(bǔ)齊至50 μL，并以PCR陰性作為陰性對(duì)照，TE Buffer作為空白對(duì)照。將反應(yīng)管置于PCR儀中孵育雜交，95 ℃加熱5 min，52 ℃孵育15 min。配置新鮮的SA-PE工作液，用1×TMAC 按照100倍稀釋SA-PE至工作濃度。將雜交孵育后的樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的濾板中，并在磁力洗板機(jī)中清洗2次。在每孔中加入100 μL 1×TMAC緩沖液，水平振蕩器上重懸磁珠1 min。加入25 μL稀釋好的SA-PE工作液。52 ℃振蕩孵育5 min。在Bio-Plex懸浮芯片檢測(cè)儀上讀取數(shù)據(jù)。

1.2.4 雜交條件優(yōu)化 從上游、下游引物比例、雜交溫度和雜交時(shí)間3個(gè)方面對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了篩選，從而優(yōu)化液相芯片雜交的條件。分別選擇上游、下游引物1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5這4個(gè)比例分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定最佳上游、下游引物比例;根據(jù)所設(shè)計(jì)4條探針的Tm值，選擇48～58 ℃的溫度范圍，并且每隔2 ℃設(shè)置溫度梯度，確定最佳雜交溫度;分別將雜交溫度設(shè)定為5、10、15、20、30 min對(duì)各病毒進(jìn)行雜交檢測(cè)，確定最佳雜交時(shí)間。

1.2.5 雜交產(chǎn)物的檢測(cè)及特異性試驗(yàn) 在Bio-Plex懸浮芯片檢測(cè)儀上對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)并讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)每孔中中位熒光值（MFI）讀數(shù)來(lái)進(jìn)行結(jié)果判定。當(dāng)檢測(cè)時(shí)每種微球的檢出數(shù)≥50且空白對(duì)照背景中位熒光值小于300，則表示結(jié)果可信。當(dāng)樣品中中位熒光值（Median florescence intensity，簡(jiǎn)稱MFI）≥300且與陰性對(duì)照的比值（qualitative criteria，簡(jiǎn)稱QC）≥3時(shí)，可判定結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.6 檢測(cè)方法的靈敏性 將構(gòu)建的PPRV病毒質(zhì)粒以及合成的各病毒序列，用無(wú)菌水進(jìn)行10倍倍比稀釋后，以各稀釋度作為模板進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，用所建立的液相芯片檢測(cè)體系對(duì)各組PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)，檢測(cè)其靈敏度。

1.2.7 樣品的檢測(cè) 利用建立的液相芯片檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)及邊境地區(qū)的106份樣品進(jìn)行了檢測(cè)。利用RNAiso Plus和Blood & Tissue Kit試劑盒分別提取樣品的RNA，并使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以4種 RNA病毒PPRV、RVFV、WNV、FMDV的引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增。將每份樣品對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合后，用所建立的液相芯片檢測(cè)體系對(duì)其進(jìn)行雜交檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR檢測(cè)

用各病毒引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA或合成的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別可擴(kuò)增出RVFV、FMDV、WNV、PPRV的大小為330、107、496、339 bp的目的片段，片段大小與預(yù)期相符，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 液相芯片雜交條件的優(yōu)化

分別對(duì)液相芯片檢測(cè)方法的雜交溫度、上下游引物比例和雜交時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。檢測(cè)時(shí)空白對(duì)照的MFI值符合雜交檢測(cè)判定結(jié)果的要求，檢測(cè)結(jié)果可信。根據(jù)雜交檢測(cè)信號(hào)結(jié)果，在上游、下游引物比例篩選結(jié)果中，WNV最佳上游、下游引物比例為1 ∶ 4，其他病毒最佳引物比例為1 ∶ 5（圖2-A）;在雜交溫度篩選結(jié)果中，F(xiàn)MDV的最佳雜交溫度為 56 ℃，其他均為54 ℃（圖2-B），確定最佳雜交溫度為54 ℃;在雜交時(shí)間篩選結(jié)果中，各病毒最佳雜交時(shí)間均為30 min（圖2-C）。

2.3 4種病毒的液相芯片特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化后的液相芯片檢測(cè)方法過(guò)對(duì)RVFV、FMDV、WNV和PPRV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各病毒間均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的特異性（表2）。

2.4 檢測(cè)方法的靈敏性

利用優(yōu)化后的液相芯片檢測(cè)方法對(duì)各稀釋度模板進(jìn)行檢測(cè)，RVFV、FMDV、WNV和PPRV起始模板濃度分別為1.08、1.12、1.17、2.15 ng/μL。根據(jù)液相芯片檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，RVFV、FMDV、WNV、PPRV 4種病毒最低檢出稀釋度均為10-6，靈敏度分別為1.08×10-4 ng/μL（2.98×105 copies/μL）、1.12×10-5 ng/μL（9.54×104 copies/μL）、1.17×10-6 ng/μL（2.15×103 copies/μL）、2.15×10-6 ng/μL（5.78×103 copies/μL）（表3）。

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

利用建立的多重液相芯片檢測(cè)方法對(duì)從養(yǎng)殖場(chǎng)及邊境地區(qū)采集的106份樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果檢出PPRV陽(yáng)性樣品15份，其余病毒檢測(cè)結(jié)果均呈陰性（表4）。陽(yáng)性樣本的PCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證均符合。

3 討論與結(jié)論

小反芻獸疫（PPR）、西尼羅熱（WN）、裂谷熱（RVF）、外來(lái)型口蹄疫（FMD）是4種《國(guó)家動(dòng)物疫病防治中長(zhǎng)期規(guī)劃》中明確指出要重點(diǎn)防范的外來(lái)動(dòng)物疫病，近年來(lái)，在我國(guó)周邊國(guó)家時(shí)有暴發(fā)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)公共衛(wèi)生安全。這些動(dòng)物疫病一旦傳入，對(duì)于野生動(dòng)物保護(hù)以及家畜養(yǎng)殖業(yè)都將是毀滅性的打擊。因此，在邊境動(dòng)物及其制品的進(jìn)出口檢疫中，如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè)這些外來(lái)疫病和防止傳入國(guó)內(nèi)顯得尤為重要。常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法雖然具有安全、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，但是同樣不能滿足邊境高通量檢測(cè)的需求。因此，急需研發(fā)一種滿足邊境高通量檢測(cè)需求且能夠快速排查、 準(zhǔn)確診斷外來(lái)動(dòng)物疫病的方法。

目前，病毒的檢測(cè)主要依靠PCR檢測(cè)技術(shù)，主要包括普通PCR和熒光定量PCR。隨著檢測(cè)通量的增加，普通PCR和熒光定量PCR的靈敏度和準(zhǔn)確性均難以保證，特別是多重?zé)晒舛縋CR的成本大大增加[14]。液相芯片系統(tǒng)是一種以流式技術(shù)為檢測(cè)平臺(tái)，不同熒光編碼的微球?yàn)檩d體，用于高通量分子檢測(cè)的新型生物芯片技術(shù)。其中以MagPlex微球應(yīng)用最為廣泛。它以磁性微球替代了原本的聚苯乙烯微球，省去了操作過(guò)程中過(guò)濾的步驟，既減少了微球的損失，也使操作更為便捷，并且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。熒光微球編碼是通過(guò)紅色和橙色2種熒光染料，每種染料分為10個(gè)濃度梯度，不同濃度的2種熒光染料相互組合可賦予微球載體100種顏色，以此來(lái)對(duì)微球進(jìn)行編碼，對(duì)1份待檢樣品中最多100個(gè)指標(biāo)進(jìn)行同步檢測(cè)。本研究建立的液相芯片檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在1個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)4種病毒，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，并且提高了檢測(cè)效率。

本研究建立的液相芯片檢測(cè)技術(shù)具有較好的特異性。本研究建立的液相芯片技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒（PPRV）的靈敏度為2.15×10-6 ng/μL（5.78×103 copies/μL）、 西尼羅熱病毒（WNV）的靈敏度為1.17×10-6 ng/μL（2.15×103 copies/μL），與其他已報(bào)道的液相芯片檢測(cè)方法靈敏度基本一致，并且與商業(yè)化的熒光定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度102～103 copies/μL也相當(dāng)[15]。 其他2種病毒RVFV和FMDV的檢測(cè)靈敏度分別為2.98×105、9.54×104 copies/μL，靈敏度相對(duì)比較低。在進(jìn)行敏感性試驗(yàn)時(shí)，多重液相芯片檢測(cè)相較于單重檢測(cè)出現(xiàn)了本底值出現(xiàn)背景信號(hào)升高的現(xiàn)象，在排除可能引起本底值背景升高的原因后，發(fā)現(xiàn)此為多重檢測(cè)中存在的正?，F(xiàn)象[16]。然而由于本底值的升高，會(huì)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的判定有一定影響，表現(xiàn)為部分探針檢測(cè)敏感性降低。隨著檢測(cè)靶基因的增多，引物擴(kuò)增效率，微球的數(shù)量以及反應(yīng)條件等都會(huì)影響液相芯片的檢測(cè)，因此，還需要通過(guò)對(duì)引物設(shè)計(jì)和液相芯片的檢測(cè)體系等條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高檢測(cè)方法的靈敏性。另外，在對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，使用多重液相芯片檢測(cè)方法檢測(cè)到小反芻獸疫病毒陽(yáng)性的樣本15份，說(shuō)明了該方法可用于臨床樣本的檢測(cè)。

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