李 帆,羅行煒,劉建華,梁 軍,賀丹丹,潘玉善,苑 麗,胡功政*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002;2.河南省鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所,河南 鄭州 450000)

0 引言

沙門氏菌是一種人獸共患病原菌,分布廣,危害大,該菌也是世界各地人類食物中毒的主要致病菌,因此,沙門氏菌的多重耐藥性對動物與人類健康構成了嚴重威脅。細菌耐藥性可通過外排泵等多種耐藥機制產(chǎn)生[1]。2003年,1個新的耐藥結節(jié)分化(RND)家族多藥外排泵oqxAB由丹麥科學家Sorensen等[2]在大腸桿菌接合性質(zhì)粒pOLA52上發(fā)現(xiàn),是首先發(fā)現(xiàn)的對喹乙醇耐藥的分子機制[3],現(xiàn)已被確定為質(zhì)粒介導的喹諾酮類的耐藥機制(PMQR)之一[4]。oqxAB由基因oqxA和oqxB組成,不僅介導對喹噁啉類藥物(喹乙醇、痢菌凈)、氯霉素的耐藥性,而且還可降低細菌對氟苯尼考、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、恩諾沙星和諾氟沙星)、TMP和替加環(huán)素等藥物的敏感性[5-7]。Kim等[8]首次從魚的巴氏桿菌多重耐藥R質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了耐氟苯尼考的基因,并將其定名為pp2flo。隨后又相繼從沙門氏菌、大腸桿菌和葡萄球菌屬中克隆到氟苯尼考耐藥基因floR、cfr和fexA。后來雞源、牛源和豬源大腸桿菌中的floR基因也相繼被報道。現(xiàn)已證實floR基因同時對氯霉素和氟苯尼考耐藥。故對編碼多藥外排泵的oqxAB以及floR基因進行檢測分析,對獸醫(yī)臨床治療及公共衛(wèi)生菌研究有重要意義。

近年來,oqxAB在腸桿菌科細菌中的檢測分析較多,主要集中在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌[7-11],而在沙門菌中的研究報道較少[12]。本文測定了分離的豬源沙門菌對外排泵oqxAB代表性相關藥物的敏感性,用PCR及測序方法檢測了oqxAB,并分析了分離菌中oqxAB基因的分布流行特點,旨在為有效控制沙門氏菌感染提供理論依據(jù);此外,對試驗菌株用ERIC-PCR方法進行了基因分型,了解oqxAB基因陽性菌之間的克隆關系,以期為進一步研究oqxAB基因的傳播擴散機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 215株已鑒定的豬源沙門氏菌于2016～2018年采集于全國7個不同的省份(陜西、山西、湖北、河南等地)。質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922由中國普通微生物菌種保管中心提供。

1.1.2 藥物及培養(yǎng)基 試驗藥物:喹乙醇(OQX,95.5%,江蘇天成動物保健品公司)、痢菌凈(MEQ,99.1%,南通市合成獸藥廠)、氟苯尼考(FFC,99.5%, Amresco公司)、恩諾沙星(ENR,99.8%,北京萬佳首化生物科技有限公司)。培養(yǎng)基: SS瓊脂、LB肉湯、MHB肉湯。

1.1.3 分子生物試劑 瓊脂糖、DNA Marker、Premix Ex Taq等購自北京康為世紀有限公司;50×TAE購自北京索萊寶有限公司。

1.1.4 主要儀器設備 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(金壇華峰儀器有限公司)、PCR擴增儀(美國ABI公司)、超凈工作臺(蘇靜集團蘇州安泰空氣技術有限公司)、GENE GENIUS全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)、電泳儀(北京市六一儀器廠)、細菌比濁儀(法國Biomerieux)、AB204-N型電子分析天平(梅特勒-托里儀器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法,分別測定喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星對分離菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concertration, MIC),按照美國臨床試驗室標準化協(xié)會(CLSI)的標準[17]及Hansen等[3]的研究結果判讀試驗結果并計算MIC50和MIC90。

1.2.2 基因檢測

1.2.2.1 提取基因組 從純化的SS瓊脂平板上挑取單個菌落接種于LB肉湯中,置于水浴恒溫振蕩器中震蕩12 h；然后吸取1 mL到1.5 mL EP管中,以12000 r/min離心5 min；棄去上清液,加入200 μL TE緩沖液,吹打至完全渾濁,在沸水中煮10～15 min,以12000 r/min離心3 min,保留上清液。

1.2.2.2 基因的PCR及測序 通過PCR擴增oqxA、oqxB和floR基因,擴增用引物參照文獻[17-18]進行設計,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

以基因DNA為模板進行PCR反應。20 μL反應體系:10 μL Premix Ex Taq酶,上、下游引物、模板DNA各1 μL, ddH2O 1 μL,設1對空白對照。反應參數(shù):94 ℃預熱5 min,94 ℃變性4 min,退火(根據(jù)不同的引物設置不同的溫度)45 s,72 ℃延伸(30 s/500 bp),循環(huán)30～35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(ERIC PCR產(chǎn)物需1.8%)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，在紫外投射儀下觀察結果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像,如果出現(xiàn)與陽性對照在同一位置的條帶即為陽性,說明該菌株攜帶有此種耐藥基因。將代表性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序,測序結果經(jīng)“http://blat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast”網(wǎng)上比對確認。

1.2.3 ERIC-PCR分型 提取oqxA或oqxB基因檢測呈陽性的豬沙門氏菌基因組為模板,利用ERIC-2[19]引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′對其進行PCR擴增,利用NTSYSpc 2.1軟件對電泳條帶進行分析,凡相似度大于75%者為同一型,代表同一克隆株。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗結果

豬沙門氏菌耐藥表型和MIC分布范圍見表1。由表1可知：215株分離菌中對喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星耐藥的分別有70、45、199和36株,耐藥率分別為32.56%、20.93%、92.56%、16.74%;對喹乙醇和痢菌凈均耐藥的有24株；喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星對豬沙門氏菌的MIC50分別為32、32、128、1 μg/mL, MIC90分別為128、64、512、8 μg/mL。

表1 4種藥物對215株豬源沙門氏菌的MIC值分布

2.2 oqxA和oqxB檢測結果

在215株豬源沙門氏菌中分別有152、159株菌攜帶oqxA和oqxB,攜帶率分別為70.70%和73.95%。有152株菌同時攜帶oqxA和oqxB,共同攜帶率為70.70%，即并未發(fā)現(xiàn)單獨攜帶oqxA的菌株。有56株菌不含任何1個oqxA或oqxB。豬沙門氏菌oqxAB基因以及floR基因擴增產(chǎn)物的電泳結果分別見圖1和圖2。攜帶oqxA或oqxB的豬源沙門氏菌對喹乙醇、痢菌凈的敏感性表型測定結果見表2。

2:攜帶oqxA的菌株樣品;4:攜帶oqxB的菌株樣品;

6:陰性對照;7:攜帶floR基因的菌株樣品;8:陽性對照。

藥物抗性菌株數(shù)(抗性率)oqxA攜帶率/%oqxB攜帶率/%喹乙醇70(70/215)82.86(58/70)84.29(59/70)痢菌凈145(145/215)64.83(94/145)68.97(100/145)

2.3 ERIC分型結果

對含有oqxA或oqxB的159株豬源沙門氏菌進行ERIC-PCR擴增,按相似度大于75%者為同一型,可分A～Q共17個型,每個型分別含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,oqxA或oqxB在各個型中均存在(圖3),說明含有oqxA或oqxB基因的菌株既來源于不同的克隆,也有部分菌株來自同一克隆。

3 討論

沙門氏菌是最常見的人畜共患病原菌之一,具有較強的致病性,對外界環(huán)境的抵抗力較強。目前,無論是人類臨床治療,還是農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)的生產(chǎn)中,抗生素仍然是對付各種病原菌的首要選擇。由于抗菌藥物的不規(guī)范使用,尤其濫用現(xiàn)象嚴重,導致耐藥菌株逐年增長,細菌耐藥問題變得愈加突出。本試驗發(fā)現(xiàn)：215株豬源沙門氏菌對喹乙醇的耐藥率為32.56%,低于王敖雪等[14]報道的肉雞沙門氏菌對喹乙醇的耐藥率(100%)，也低于狄文婷等[15]描述的豬源沙門氏菌對喹乙醇的耐藥率58.3%；本試驗豬源沙門氏菌對氟苯尼考的耐藥率為92.56%，明顯高于黃凱等[16]報道的對氟苯尼考的耐藥率(66.67%);對恩諾沙星的耐藥率為16.74%,明顯低于劉艷紅等[17]報道的豬源沙門氏菌和大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥率(66.7%)。這種耐藥率的差異,可能與養(yǎng)豬場的地理位置、所處環(huán)境不同,抗生素的使用方法和劑量有關。本試驗還發(fā)現(xiàn),有11.16%的菌株對喹乙醇和痢菌凈同時耐藥,說明豬源沙門氏菌對喹噁啉類藥物存在一定的交叉耐藥性。

從表1和表2可以看出,豬源沙門氏菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為70.70%和73.95%,同時攜帶oqxA、oqxB的菌株所占比例為70.70%,說明oqxAB已有較高的流行率。宮艷彬等[18]報道的死亡鴨胚沙門菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為9.46%和2.70%,遠低于本試驗所報道的數(shù)據(jù)。江萍等[19]報道的新疆地區(qū)豬源沙門氏菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為64.7%和65.5%,這與本試驗數(shù)據(jù)基本相近。由此可以看出,因地理位置不同,菌株來源及宿主不同,分離菌中oqxA和oqxB的攜帶率存在較大的差異。本試驗菌株采集自全國7個省份,較為廣泛,具有一定的代表性。oqxA和oqxB位于同一操縱子上,本試驗中oqxA的檢出率低于oqxB的檢出率,可能是由于oqxA引物的結合位點存在突變而使部分菌株的oqxA無法檢出。此外,在215株豬源沙門氏菌中分別有152和159株菌攜帶oqxA和oqxB,但是分別只有70和45株菌對喹乙醇和痢菌凈耐藥。在本試驗中，豬源沙門氏菌菌株對oqxA和oqxB的攜帶率(分別為70.70%和73.95%)遠遠高于對喹乙醇和痢菌凈的耐藥率(分別為32.56%和20.93%),表明部分oqxA或oqxB基因并未表達。同時,在對喹乙醇耐藥的菌株中，oqxA和oqxB的檢出率分別為82.86%和84.29%,高于對喹乙醇不耐藥的菌株中oqxA和oqxB的檢出率(分別為64.83%和68.97%)。說明oqxA和oqxB是導致細菌對喹乙醇耐藥的主要機制。而對氟苯尼考的耐藥率為92.56%,明顯高于floR的檢出率72.56%,這可能是由于新的耐藥基因或本試驗中未檢測的其他有關耐藥基因的存在,同時還有可能是oqxA、oqxB的存在致使氟苯尼考的耐藥性增強。

圖3 含有oqxA或oqxB基因的菌株ERIC分型圖

由圖3的ERIC-PCR結果可以看出,含有oqxA或oqxB的159株豬源沙門氏菌可分為A～Q共17個ERIC型,各個型分別含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,由此可見含有oqxA或oqxB的豬源沙門氏菌分離株多數(shù)來自不同的克隆株,oqxA和oqxB廣泛存在于不同的克隆菌株中。