范琳琳 伍天苔 王 繪 張 平 何 康

(貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴州省苗醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002)

苗藥啊咳知，為水龍骨科 (Polypodiaceae)石韋屬(Pyrrosia) 植物廬山石韋 (Pyrrosia sheareri (Bak.) Ching) 的全草。苗藥啊咳知在貴州苗族地區(qū)用于治療感染及腹瀉，在仡佬族用于抗感染以及在毛南族用于治療支氣管炎等。文獻(xiàn)顯示廬山石韋中含有綠原酸和芒果這2種有效成分[1,2]，具有抗菌抗炎和抗菌抗病毒等作用，能較典型的反映出該藥的主治和功效，且綠原酸為藥典的指標(biāo)性成分。本實(shí)驗(yàn)在他人研究成果上進(jìn)一步探索[3-10]，建立一套科學(xué)的提取方案，為其資源的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100系列高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，四元泵：美國，安捷倫公司)，梅特勒-托利多New classic型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，多功能粉碎機(jī)(上海北申科技有限公司)。

1.2 試劑與試藥 甲醇為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；水為二次蒸餾水；綠原酸對(duì)照品(購于西南麥克斯藥品純度≥98%，批號(hào)140718002)；芒果苷對(duì)照品自制，純度≥98%；廬山石韋藥材采自貴州道真，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定為水龍骨科石韋屬植物廬山石韋(Pyrrosia sheareri (Bak.)Ching)藥材，曬干后用粉碎機(jī)將其粉碎，過50目篩，備用；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定綠原酸和芒果苷含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱phenomenex-C18(4.6×150mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(B)-0.2%磷酸水溶液(C)梯度洗脫，洗脫程序：0～10min，8%B；10～55min，50%B；55～65min，100%B；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取綠原酸、芒果苷對(duì)照品1mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品濃度為0.1 mg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定廬山石韋藥材粉末0.5000g，加50%甲醇25ml于具塞錐形瓶中，精密稱重，超聲提取45min，稱重，以50%甲醇補(bǔ)足失重，過濾，取續(xù)濾液過0.45μL微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1μL，3μL，5μL，7μL，10μL分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析。綠原酸的回歸方程為Y=2.9599X-4.2246，r=0.9998；芒果苷的回歸方程為Y=1.1964X-2.6344，r=0.9996。結(jié)果表明呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得綠原酸峰面積RSD = 3.04%，芒果苷峰面積RSD = 2.97%，精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批廬山石韋進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)6次，約0.5g，精密稱定，測(cè)得綠原酸平均含量 = 0.7456mg/g，RSD = 2.89%，芒果苷平均含量 = 0.2189mg/g，RSD = 1.43%。結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸和芒果苷峰面積值，結(jié)果綠原酸平均含量0.7484mg/g，RSD = 0.76%；芒果苷平均含量0.2208mg/g，RSD =1.85%。結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批廬山石韋6份，約0.25g，精密稱定，加入一定量的綠原酸和芒果苷對(duì)照品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果如表1和表2所示，回收率良好。

表1 綠原酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 芒果苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 超聲提取工藝考察

2.2.1 乙醇濃度的考察 精密稱取0.5000 g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL)依次加入20、40、60、80、90%濃度的乙醇，在60W功率下超聲30 min。以HPLC法測(cè)定綠原酸、芒果苷的得率。結(jié)果，綠原酸和芒果苷的得率在乙醇濃度40%到80%之間隨濃度的升高而先增加后減少，在60%時(shí)達(dá)到峰值。

2.2.2 超聲時(shí)間的考察：精密稱取0.5000 g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL) 加入60%濃度的乙醇，60 W功率下分別超聲10、20、30、40、50 min。以HPLC法測(cè)定綠原酸、芒果苷的得率。結(jié)果，芒果苷的得率一直持上升趨勢(shì)，而當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，綠原酸的得率到達(dá)峰值。

2.2.3 料液比的考察 取0.5000g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，分別按料液比為1:5、1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)依次加入60%濃度的乙醇，60W功率下超聲30min。以HPLC法測(cè)定綠原酸、芒果苷的得率。結(jié)果，當(dāng)料液比為1:20逐步增大時(shí)，綠原酸和芒果苷的得率也不停增加。

2.2.4 超聲功率的考察 精密稱取0.5000g廬山石韋粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比為1:20 (g/mL)加入60%濃度的乙醇，分別選取40、60、80、100 W功率下超聲30 min。以HPLC法測(cè)定綠原酸、芒果苷的得率。結(jié)果，綠原酸在超聲功率60W時(shí)得率最大，同時(shí)超聲功率越大，芒果苷的得率越低。

2.2.5 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)如表3～4所示，結(jié)果見表5～6。

直觀分析結(jié)果表明，各因素對(duì)綠原酸得率的影響順序?yàn)锳>B>D>C，即乙醇濃度>超聲時(shí)間>固液比>超聲功率；影響芒果苷超聲提取得率的順序?yàn)锳>D>B=C，即醇濃度>固液比>超聲時(shí)間=超聲功率。方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)廬山石韋中有效成分綠原酸和芒果苷的影響無顯著性差異(P>0.05)。綠原酸最優(yōu)水平組合為A3B2C1D2，芒果苷最優(yōu)水平組合為A3B1C1D3或A3B1C2D3。即廬山石韋中綠原酸最優(yōu)方案為：乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為40W，固液比為1:30 g/mL；芒果苷最優(yōu)提取方案為：乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間為20min，超聲功率為40或80W，固液比為1:40 g/mL。

表3 因素水平表

表4 正交試驗(yàn)表

表5 綠原酸方差分析表

表6 芒果苷方差分析表

3 討論

如今并沒有科研人員對(duì)超聲提取廬山石韋中綠原酸和芒果苷有效成分進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)利用超聲提取法快速高效從植物中提取綠原酸和芒果苷。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)廬山石韋中綠原酸和芒果苷的超聲提取方法進(jìn)行了研究和優(yōu)化，所建立的超聲提取方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于該植物含量測(cè)定的高效快速提取。實(shí)驗(yàn)利用指標(biāo)性成分的提取率，考察了不同乙醇濃度，超聲時(shí)間，料液比及超聲功率對(duì)綠原酸和芒果苷得率的影響，摸索出一套合理高效的超聲提取方法，即廬山石韋中綠原酸最優(yōu)方案為：乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間為30min，超聲功率為40W，固液比為1:30 g/mL；芒果苷最優(yōu)提取方案為：乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間為20min，超聲功率為40或80W，固液比為1:40 g/mL。

貴州廬山石韋資源較多，提取其有效部位或有效成分可用于臨床醫(yī)療、食品添加以及美容保健等。一套科學(xué)高效的提取方案對(duì)其制藥和開發(fā)具有重大的意義。