烏仁圖雅 楊烏日娜 趙薩茹拉 賀喜格達(dá)來(lái)

(鄂爾多斯市蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017010)

嘎日迪-13味丸(扎沖-13味丸)是蒙醫(yī)常用藥,由訶子、草烏、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚、珍珠、丁香、肉豆蔻、沉香、禹糧土、磁石、甘草等13味單藥組成[1],出自《至高要方》古籍。現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊(cè))》[2]，在《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書》《蒙藥方劑學(xué)》(統(tǒng)編教材)[3]均有記載。主要功能是祛風(fēng)通竅，舒筋活血，鎮(zhèn)靜安神，除“協(xié)日烏素”;主治半身不遂，左癱右瘓，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言語(yǔ)不清，筋骨疼痛，神經(jīng)麻痹，風(fēng)濕，關(guān)節(jié)疼痛。實(shí)驗(yàn)研究表明，具有抗血栓、抗真菌抗炎[4]、清除自由基[5]、腦缺血損傷保護(hù)作用[6-8]。臨床研究表明，嘎日迪 -13 治療糖尿病周圍神經(jīng)病變[9]、腦埂塞[10]、腰椎間盤突出癥[11]等療效確切，未見(jiàn)嘎日迪 -13 抗真菌感染相關(guān)的報(bào)道。

白色念珠菌又名白色假絲酵母菌,是一種人類和動(dòng)物共患的深部條件致病性酵母菌,該菌可引起人的黏膜、皮膚、消化道、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)等感染,引起白色念珠菌病(簡(jiǎn)稱念珠菌病)。隨著免疫抑制劑、抗生素及侵入性治療方法的廣泛應(yīng)用,免疫低下患者數(shù)量逐年增加,真菌感染日漸增多,危及生命的深部真菌感染已成為醫(yī)院監(jiān)測(cè)和研究的重點(diǎn)[12]。白色念珠菌是目前深部真菌感染中最常見(jiàn)、最主要的病原體之一,深部白色念珠菌感染的病死率高達(dá)68.90%[13]。

本試驗(yàn)在綜合文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，考慮乙醇提取濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間等多種影響因素，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)以浸膏得率及抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(MIC90)值為指標(biāo)，對(duì)嘎日迪-13味丸提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。

1 材料與方法

1.1 蒙成藥 嘎日迪-13丸(內(nèi)蒙古鄂爾多斯市蒙醫(yī)研究所制，批號(hào)20170524)。

1.2 菌株及培養(yǎng)基 白色念珠球菌 (candida albicans)(菌種編號(hào)98001)由中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買。RPMI1640 sigma R8755-10×1L、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

1.3 主要儀器和試劑 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC163320)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、生物安全柜(BSC1500ⅡA2-X型山東博訊)、BSP250型生化培養(yǎng)箱(山東博訊)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、干燥箱、中藥粉碎機(jī)、二甲亞砜(DMSO)、無(wú)水乙醇、蒸餾水。

1.4 有效成分提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以料液比(A)、提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間/次(C)及溶媒濃度(D)為考察對(duì)象，并根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)依據(jù)，擬定各因素的3水平(表1)，以提取物有效成分的得率、浸膏MIC值為綜合考察指標(biāo)，選用 L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而篩選出最佳的提取工藝條件。

按規(guī)定量稱取藥物9份，每份約10g ，分別粉碎并編號(hào)1～9 ；精確稱量9份藥物粉末，于溶媒中加熱回流提取，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入105℃烘箱中3h ，直至烘干到恒重浸膏狀態(tài)，測(cè)質(zhì)量并計(jì)算得率，封存?zhèn)溆茫謩e重復(fù)3次。見(jiàn)表1。

表1 嘎日迪-13提取工藝主要因素

1.5 正交試驗(yàn)蒙藥有效成分的體外抑菌活性試驗(yàn)

1.5.1 菌懸液的制備 制備RPMI1640液體培養(yǎng)基和 PDA培養(yǎng)基，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取試?yàn)所用白色念珠菌菌種接種至PDA平板，28℃培養(yǎng)1周，活化2次，使菌落均勻覆蓋PDA平板。用接種針挑取菌落于適量生理鹽水，并用吸管吹打菌落，使菌游離于生理鹽水中。經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.5.2 藥液的制備 精確稱取各正交試驗(yàn)的提取物浸膏溶于10% DMSO中，配制成浸膏質(zhì)量濃度為64mg/mL的溶液備用。臨用前將藥液用RPMI1640培養(yǎng)液按倍比稀釋法稀釋至工作濃度，提取物的工作濃度為32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06.0.03 mg/mL。

1.5.3 藥敏試驗(yàn)方法 無(wú)菌96孔平底板(U型)微量板用紫外燈照射30min后，在每一排1～10孔內(nèi)分別加入藥物工作濃度100μL ，然后再加入上述制備的真菌菌液100μL，第11孔為陰性對(duì)照(只含RPMI1640培養(yǎng)液100 μL 和藥物100 μL ，不含菌液)，12孔為陽(yáng)性對(duì)照(只含培養(yǎng)液100 μL和菌液100 μL ，不含藥物)。置于微量振蕩板上振蕩5min ，使各種液體充分混勻，35℃培養(yǎng)48h ，MIC90(最低抑菌濃度)值的判讀：將藥敏板每孔生長(zhǎng)情況與陽(yáng)性及陰性對(duì)照管相比較，以肉眼觀察10%培養(yǎng)物生長(zhǎng)的最低藥物濃度孔作為觀察終點(diǎn)，其濃度為 MIC90值。

2 結(jié)果

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取方法進(jìn)行嘎日迪-13有效成分的提取，得到9份嘎日迪-13有效提取物。通過(guò)對(duì)提取得到的各浸膏得率的計(jì)算及浸膏物質(zhì)對(duì)白色念珠菌 MIC90值的研究分析，得出每個(gè)正交水平的有效部位得率及其對(duì)白色念珠菌MIC90值，分別計(jì)算各組試驗(yàn)結(jié)果的綜合平均值 K1、 K11、K2 、K21和 K3、K31，極差 R1、R2，結(jié)果見(jiàn)表2。4個(gè)因素對(duì)嘎日迪-13提取物得率的影響大小順序?yàn)椋?B>D>A>C ，以得率為指標(biāo)的最優(yōu)水平組合為 B3D1A3C2，即20倍量50%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次 60min；4個(gè)因素對(duì)嘎日迪-13提取物 MIC90的影響大小順序?yàn)椋篋>A=B>C，以 MIC90為指標(biāo)的結(jié)果為D2A1B2C2、D1A2B2C3、D2A2B3C1、D2A3B1C3、D3A3B2C1、D1A3B3C2等6組同樣顯示最佳抑菌效果。綜上所述，嘎日迪-13的最佳提取工藝為20倍量50%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次 60min 。見(jiàn)表2。

表2 嘎日迪-13最佳提取工藝直觀分析

3 小結(jié)

嘎日迪-13是從蒙藥方吉朱木道爾吉、嘎日迪-5、巴特爾-7、洪古日-12等"殺粘"蒙藥中篩選出抗白色念珠菌作用最強(qiáng)的處方。本試驗(yàn)表明，篩選出的嘎日迪-13提取工藝具有抑制白色念珠菌的作用，MIC90為2mg/mL。