哈申高娃 閆鳳杰 莫日根高娃

(1.通遼市科左后旗疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 通遼 028100； 2.通遼市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

金露梅為薔薇科植物金露梅(Potentilla fruicosa L.)及小葉金露梅(Potentilla parvifolia)的帶花莖枝。蒙藥名阿拉坦-烏日拉格，別名哈日-本瑪，始載于蒙藥經(jīng)典著作《蒙醫(yī)正典》《認(rèn)藥學(xué)》等[1]。槲皮素為金露梅中含有的主要成分之一，金露梅枝條含有槲皮素、山奈酚、午車(chē)菊素、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸鞣質(zhì)和醌類成分。研究表明，槲皮素具有祛痰、止咳平喘、降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量等作用。用于治療慢性支氣管炎、冠心病及高血壓病[2]。本文采用高效液相色譜法，測(cè)定7種不同產(chǎn)地的金露梅中槲皮素的含量并加以比較。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 (1)UHPLC一Ulti Mate3000高效液相色譜儀、N2000色譜工作站、SPD一10A型紫外檢測(cè)器；(2) LC-16A高效液相色譜儀、Labsolutions Essentia-Lite軟件包色譜工作站、SPD-16紫外可見(jiàn)雙波長(zhǎng)檢測(cè)器。AB135-S型電子分析天平(梅特勒一托利多)。 KQ一250型超聲波清洗機(jī)〔鞏義予華儀器廠)。

1.2 試藥與試劑 甲醇為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為試驗(yàn)用高純水。其它試劑為分析純。

1.3 藥材及對(duì)照品 7種不同產(chǎn)地的金露梅，內(nèi)蒙古根河、內(nèi)蒙古阿爾山、內(nèi)蒙古根河潮源、內(nèi)蒙古圖里河、內(nèi)蒙古蠻漢山、黑龍江塔河、黑龍江漠河。1～5樣品分別于2016年8月14～9月3日采集，6～7樣品于2017年8月20～21日采集，經(jīng)內(nèi)蒙古通遼市食品藥檢所安文源主任藥師鑒定，確定為真品。

槲皮素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100081-201610 ,含量為99.1%，使用前105℃干燥2h。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件 流動(dòng)相:甲醉-0.1%磷酸溶液(60:40)，檢測(cè)波長(zhǎng):360nm,流速:1.0mL/min，柱溫：30℃，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品0.02237g(含量為99.1%)，加甲醇定溶至100mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.2216mg/mL的對(duì)照品溶液，取該溶液10mL，加甲醇定溶至100m容量瓶中，即得濃度為0.0222mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品藥材粉末(全部通過(guò)三號(hào)篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇-25%鹽酸(4:1)50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液(濃度為0.2216 mg/mL的對(duì)品溶液)3.0mL、5.0mL、10.0.0mL、15.0mL，分別定溶于100mL量瓶中，搖勻，得到濃度分別為0.0666 mg/mL、0.1110mg/mL、0.222mg/mL、0.333mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果槲皮素在0.666μg-3.333μg范圍內(nèi)，峰面積值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)，峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=0.0074X+0.0007，r=0.9999。

2.4 精密度試驗(yàn) 取1號(hào)樣品0.1g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成精密度試驗(yàn)溶液，精密吸取樣品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積平均值分別為4.5957； RSD為 0.76% 。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一批供試品溶液(1號(hào)樣品)10μL，分別于0、2.5、5.5、8.5、10.5h注入液相色譜儀，測(cè)定并記錄峰面積值，結(jié)果峰面積平均值分別為4.8848，RSD=0.82%，表明供試品溶液在10.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一供試品細(xì)粉(1號(hào))6份，精密稱取各1g，按2.2.2制備成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定每份供試品峰面積值，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為3.0808mg/g，RSD=0.83%，表明本試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的1號(hào)樣品5份，各取約0.5g，精密稱定，精密稱定，加入適量的槲皮素對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制成加樣回收溶液。分別精密吸取樣品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，按下列公式計(jì)算回收率，結(jié)果果見(jiàn)表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明，平均回收率為95.93%，RSD為0.96%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 樣品含量測(cè)定

取2.2.2項(xiàng)下方法制備的7批供試品溶液各10μL 注入液相色譜儀記錄色譜圖及峰面積值，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每批供試品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。該條件下槲皮素峰保留時(shí)間為8.95min。

4 空白干擾試驗(yàn)

精密吸取空白溶劑10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果溶劑在與槲皮素相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明溶劑對(duì)槲皮素含量測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品和空白溶劑色譜圖譜，見(jiàn)圖1。

表2 樣品中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果

5 討論

5.1 含量測(cè)定 本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)7種不同產(chǎn)地的金露梅中槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果7種產(chǎn)地藥材含槲皮素都較高，有所差別，在2.0958～5.8976mg/g之間，造成含量差別大的原因可能是生長(zhǎng)環(huán)境不同有關(guān)。

5.2 樣品測(cè)定試驗(yàn)中兩種液相色譜儀測(cè)定，1～5號(hào)樣品是用UHPLC-Ulti Mate3000高效液相色譜儀，6～7號(hào)樣品是用LC-16A高效液相色譜儀，所以測(cè)得的峰面積值單位不同。

5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定槲皮素的吸收光譜，并參照文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，確定測(cè)定波長(zhǎng)為360nm。

5.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論塔板數(shù)>5000，拖尾因子為1.04。檢測(cè)過(guò)程中系統(tǒng)較穩(wěn)定。

5.5 本方法操作簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，專屬性強(qiáng)，能有效控制金露梅中槲皮素的含量，為金露梅質(zhì)量控制提供依據(jù)。