王娟 黃炳臣 吳雪銘 羅春英 蘇群英 黃永秩 陸海善 林潔 王超 黃小英 龍喜帶

【摘要】目的探討DNA聚合酶δ3（POLD3）在肝細(xì)胞癌（HCC）中的表達(dá)及臨床意義。方法通過免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)POLD3在134對(duì)HCC腫瘤組織與腫瘤旁組織樣本中的表達(dá)，通過實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)和蛋白印跡法檢測(cè)SMCC-7721及QSG-7701中POLD3的表達(dá)情況。結(jié)果（1）與腫瘤旁組織相比較，POLD3 mRNA及蛋白在HCC腫瘤組織中的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；體外細(xì)胞學(xué)結(jié)果與之相一致。（2）POLD3表達(dá)與HCC腫瘤大小相關(guān)，POLD3表達(dá)水平越低者，具有更大的腫瘤直徑（P=0.017）。（3）POLD3表達(dá)與HCC腫瘤組織學(xué)分化程度相關(guān)，POLD3表達(dá)水平越高者，其腫瘤分化程度越高（P=0.001）。結(jié)論P(yáng)OLD3在HCC腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤組織學(xué)分化程度及大小相關(guān)，這些結(jié)果提示POLD3表達(dá)可能促進(jìn)HCC的發(fā)生與演進(jìn)。

【關(guān)鍵詞】POLD3；肝細(xì)胞癌；表達(dá)；臨床病理意義

中圖分類號(hào)：R735.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.05.001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinicopathological significance of DNA polymerase delta （POLD3） in hepatocellular carcinoma （HCC）.MethodsThe expression of POLD3 in 134 pairs of HCC tumor tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）.And the expression of POLD3 in SMCC-7721 and QSG-7701 cells was analyzed by RT-qPCR and western-blotting assay.ResultsThe expression of POLD3 mRNA and protein in tumor tissues with HCC decreased while comparing with that in the peri-tumor tissue，and difference was statistically significant（P<0.05）.This decreasing POLD3 expression in tumor tissues was consistent with the results from in vitro analyses.（2） The expression of POLD3 was associated with tumor size，and the lower the level of POLD3 expression，the larger the tumor diameter（P=0.017）.（3）The expression of POLD3 was related to histological differentiation of tumor，and individuals with increasing expression level of POLD3，would have higher degree of tumor differentiation （P=0.001）.ConclusionThe expression of POLD3 is down-regulated in the tumor tissues of HCC and is related to the degree and size of histological differentiation，which suggests that the expression of POLD3 may promote the development and progression of HCC.

【Key words】POLD3；HCC；expression；clinicopathological significance

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤的具體發(fā)病機(jī)制仍為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[1～2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶δ3（DNA polymerase delta，POLD3）是一種重要的DNA修復(fù)基因，對(duì)維持基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的，它的突變體和表達(dá)失調(diào)影響細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物學(xué)行為，涉及胃腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[3～11]。然而，有關(guān)POLD3在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義如何，至今為止國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道甚少。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象HCC研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)如下：經(jīng)病理診斷確診為HCC的患者、術(shù)前無放療與化療、具有完整的臨床病理資料、具有可供研究的合適組織樣本、患者本人同意參與本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：未經(jīng)病理組織診斷確認(rèn)者、術(shù)前具有放化療史者、資料不完整者、無可用于研究分析的合適樣本者、不同意參與者。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，在2012年1月至2017年10月間共收集到134例符合要求的HCC研究對(duì)象，收集所有研究對(duì)象的石蠟組織標(biāo)本用于POLD3蛋白表達(dá)分析；此外，我們也收集到12例新鮮組織樣本用于POLD3 mRNA表達(dá)分析。在本研究中，我們定義腫瘤組織為HCC癌組織，腫瘤旁組織為距離腫瘤邊緣5 cm處的肝組織。

1.2細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)HCC細(xì)胞SMCC-7721和非HCC肝細(xì)胞QSG-7701均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，所有細(xì)胞均在含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2氣體和37 ℃的恒溫環(huán)境。

1.3臨床標(biāo)本收集根據(jù)前述研究對(duì)象的入選與排除標(biāo)準(zhǔn)，收集在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院符合要求的134例肝癌患者，按Edmondson-Steiner分級(jí)法（原發(fā)性肝癌診療規(guī)范，2017年版）進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)為高分化肝細(xì)胞性肝癌，98例；Ⅲ～Ⅳ級(jí)為中低分化肝細(xì)胞性肝癌，36例。

1.4POLD3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)分別使用免疫組織化學(xué)法及蛋白印跡法檢測(cè)組織樣本與細(xì)胞樣本中的POLD3蛋白表達(dá)水平，POLD3抗體購自Santa Cruz生物科技公司，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陽性與陰性對(duì)照，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程完成，結(jié)果經(jīng)高年資病理醫(yī)師確認(rèn)。POLD3蛋白的陽性定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，以有明顯的棕色顆粒作為陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，具體的判定方法見參考文獻(xiàn)[12]。

1.5POLD3 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)按照已報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)新鮮組織樣本和體外培養(yǎng)的細(xì)胞樣本中的POLD3 mRNA表達(dá)水平[3]，在本研究，我們以ACT作為內(nèi)參，采用2-△△定量法線性化分析POLD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)比較組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1POLD3蛋白在HCC的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：與腫瘤組織相比，POLD3蛋白在HCC腫瘤旁組織中具有更高的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1A和1B，表1。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示癌細(xì)胞中的POLD3蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1C。

2.2POLD3 mRNA在HCC組織中的表達(dá)我們通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了12例新鮮HCC組織中POLD3 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與腫瘤旁組織相比，腫瘤組織中的POLD3 mRNA表達(dá)水平下降，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表2。體外細(xì)胞學(xué)分析有類似發(fā)現(xiàn)。見表3。

2.3POLD3表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系POLD3與HCC組織學(xué)分化程度、腫瘤直徑大小之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與其他病理特征的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3討論

POLD3作為POLD的第三個(gè)亞基，在各項(xiàng)生命活動(dòng)中起到DNA修復(fù)的作用，在染色體復(fù)制過程中同樣起到重要的作用，其功能一直被研究者關(guān)注著。POLD3能穩(wěn)定POLD1-POLD2的相互調(diào)節(jié)作用，并且通過C-終端PIP盒便于POLD復(fù)合體與PCNA的相互調(diào)節(jié)作用、參與跨損傷合成及DNA甲基化的進(jìn)程[13～20]。Hirota K等[21]研究表明，POLD3有助于跨損傷合成在復(fù)制叉上操作或關(guān)閉復(fù)制叉的作用，但在后復(fù)制間隙填充的作用不明顯。Murga M等[22]發(fā)現(xiàn)POLD3在RS誘導(dǎo)DNA修復(fù)過程中的DNA合成具有獨(dú)特的作用，且通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)得到POLD3缺陷導(dǎo)致復(fù)制應(yīng)激和細(xì)胞死亡。Zhou Z等[23]發(fā)現(xiàn)POLD3在小鼠胚胎干細(xì)胞和精母細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DSB）修復(fù)、端粒維持和基因組穩(wěn)定性中都起著重要作用。西班牙國家癌癥研究中心的研究人員發(fā)現(xiàn)了POLD3在DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵作用，沒有POLD3的細(xì)胞不分裂，細(xì)胞就會(huì)死亡，甚至是胚胎發(fā)育的過程和新生物體的誕生都可能被削減；沒有POLD3的細(xì)胞就會(huì)喪失復(fù)制基因組的能力而發(fā)生死亡。對(duì)于這種現(xiàn)象不僅存在于腫瘤細(xì)胞，正常的細(xì)胞也是如此，但是POLD3在正常細(xì)胞有多大程度的作用是至關(guān)重要的，目前對(duì)于POLD3在正常細(xì)胞的這種功能尚不是很清楚。

近幾年，學(xué)者發(fā)現(xiàn)POLD3與腫瘤的形成有著密切聯(lián)系，其調(diào)控異?？赡軐?dǎo)致癌細(xì)胞惡性分化、增殖。陸茵茵等[3]發(fā)現(xiàn)POLD3在胃腺癌中表達(dá)下調(diào)，且這種表達(dá)下調(diào)與腫瘤分化、增殖及預(yù)后不良相關(guān)。Dunlop等[4]通過大樣本病例對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)POLD3的基因其中一個(gè)位點(diǎn)的突變體與大腸癌的發(fā)生相關(guān)，且POLD3在該位點(diǎn)突變后形成的突變體能夠增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，然而他們并沒有探討POLD3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及分析其與臨床病理參數(shù)是否存在一定的關(guān)系。Willis等[5]采用meta分析眾多卵巢癌中POLD3的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)后不良的卵巢癌患者中POLD3表達(dá)減少。

為了探討POLD3與肝癌臨床病理特征之間是否存在一定的關(guān)系，我們從肝癌組織和肝癌細(xì)胞株兩個(gè)方面進(jìn)行了研究；在臨床上我們通過一系列的篩選標(biāo)準(zhǔn)最后收集134對(duì)符合要求的標(biāo)本。本課題一方面通過IHC、WB技術(shù)檢測(cè)肝癌腫瘤組織、癌旁組織、肝癌細(xì)胞株及肝細(xì)胞株中POLD3蛋白的表達(dá)情況，另一方面通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)12例新鮮肝組織、人肝癌細(xì)胞株SMCC-7721及人肝細(xì)胞株QSG-7701中POLD3mRNA的表達(dá)情況。通過研究我們發(fā)現(xiàn)POLD3在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這種異常表達(dá)既出現(xiàn)在蛋白水平，也出現(xiàn)在mRNA水平上。我們得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肝癌組織學(xué)分化程度越高，POLD3的表達(dá)越高；肝癌直徑越大，POLD3的表達(dá)越低，暗示著POLD3與肝癌的分化、增殖相關(guān)。這一點(diǎn)與以上學(xué)者所得到的研究結(jié)果相一致，我們猜測(cè)干擾POLD3基因的突變可以抑制肝癌的惡性分化、增殖，這也許對(duì)于肝癌及其相關(guān)腫瘤是一種有重要價(jià)值的研究結(jié)果。

因此，不管是從正常的生命活動(dòng)還是從腫瘤形成的過程，進(jìn)一步探討POLD3基因的調(diào)控機(jī)制與腫瘤之間的關(guān)系，這將為腫瘤治療提供新的選擇，為未來靶點(diǎn)治療提供新的思路。

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（收稿日期：2018-09-06修回日期：2018-10-16）

（編輯：潘明志）