舒慶雪，徐源，何成松

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜細(xì)胞增生、骨和軟骨破壞、血管新生為基本病理改變的自身免疫性疾病。其中，持續(xù)的血管新生一方面為滑膜細(xì)胞增生提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面亦使更多的炎性因子和細(xì)胞因子浸潤(rùn)滑膜，促進(jìn)并維持血管翳的形成[1]。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在RA患者滑膜組織及血漿中高表達(dá)，與疾病活動(dòng)性相關(guān)并加重疾病發(fā)展[2,3]，因此，VEGF過度表達(dá)是導(dǎo)致RA滑膜血管翳形成的關(guān)鍵。近期，有研究發(fā)現(xiàn)多配體蛋白聚糖-2(SDC-2)通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移在血管新生過程中扮演重要角色，且需與VEGF相互結(jié)合方能發(fā)揮作用[4,5]。并有實(shí)驗(yàn)表明SDC-2在RA滑膜組織血管中高度表達(dá)[6]。而目前SDC-2作為膜受體與RA的血管新生及疾病活動(dòng)研究甚少，并鮮有提及與VEGF的關(guān)系。2018年1～2月，我們通過ELISA和免疫組化法分別對(duì)RA患者外周血和關(guān)節(jié)滑膜組織中的SDC-2和VEGF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并探討二者與疾病活動(dòng)的相關(guān)性，為RA的診斷治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8～12月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的RA患者49例(病例組)，男15例、女34例，年齡25～68(54.38±9.07)歲。RA患者關(guān)節(jié)壓痛個(gè)數(shù)及關(guān)節(jié)腫痛個(gè)數(shù)分別是(13.02±9.58)、(7.41±8.32)個(gè)，C反應(yīng)蛋白(CRP)為(50.49±54.78) mg/L、紅細(xì)胞沉降率(ESR)為(79.22±35.58) mm/h、類風(fēng)濕因子(RF)為(177.45±143.71) IU/mL、抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體(MCV)為(373.47±291.04)U/mL、28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)指數(shù)(DSA28)評(píng)分為(5.19±1.44)分。另收集5例于四川大學(xué)華西醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本，男1例、女4例，年齡43～67(58.60±9.29)歲?；颊呔厦绹?guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)及歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會(huì)發(fā)布的2010年ACR/EULAR的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)，并排除感染、腫瘤和其他風(fēng)濕免疫性疾病。患者對(duì)本研究知情同意。選取西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者30例作為對(duì)照組，男9例、女21例，年齡26～64(51.6±7.01)歲。收集3例于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科行關(guān)節(jié)置換骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者的關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本為對(duì)照組，男1例、女2例，年齡44～64(55.67±10.41)歲。

1.2 血清SDC-2、VEGF檢測(cè) 分別采集病例組及對(duì)照組清晨空腹外周靜脈血5 mL，室溫靜置30 min后離心分離血清(3 000 r/min，10 min)，取血清置于-80 ℃保存。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清SDC-2、VEGF水平。每板同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、正常對(duì)照，每一標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔。嚴(yán)格按照操作指南進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，質(zhì)量控制和定標(biāo)結(jié)果均在要求范圍內(nèi)。

1.3 關(guān)節(jié)滑膜組織中SDC-2、VEGF表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化Envision法檢測(cè)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織切片為正常對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)為陰性對(duì)照。操作步驟：常規(guī)脫蠟和水化；高壓抗原修復(fù)；消除內(nèi)源性酶活性；滴加一抗，27 ℃孵育1 h；滴加二抗；DAB 顯色；蘇木素復(fù)染；稀鹽酸分化，飽和碳酸鋰反藍(lán)；脫水、透明、封片。結(jié)果判定：SDC-2、VEGF以胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5% 為0分,5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分;結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度評(píng)分乘積進(jìn)行綜合評(píng)定：0～2分為陰性(-)，3～4分為陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組血清SDC-2、VEGF水平比較 病例組與對(duì)照組血清SDC-2水平分別為(159.23±59.17)、(112.39±21.54)pg/mL，VEGF水平分別為(85.13±91.39)、(24.20±8.14)pg/mL，兩組血清SDC-2、VEGF水平比較，P均<0.01。

2.2 RA、OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中SDC-2、VEGF表達(dá)比較 SDC-2、VEGF主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒。RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中SDC-2結(jié)果為-者2例，+者2例，++者1例，陽(yáng)性表達(dá)率為60%；VEGF結(jié)果為-者1例，+者2例，++者1例，+++者1例，陽(yáng)性表達(dá)率為80%。而3例OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中SDC-2及VEGF結(jié)果均為-。與OA患者相比，SDC-2及VEGF在RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織中高表達(dá)(P均<0.01)。

2.3 RA患者血清中SDC-2、VEGF與CRP、ESR、RF、MCV、DSA28的相關(guān)性分析 RA患者中SDC-2、VEGF水平與CRP、ESR、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、DSA28呈正相關(guān)(P均<0.01)，與RF、MCV無相關(guān)性。見表1。

表1 RA患者血清中SDC-2、VEGF與CRP、ESR、RF、MCV、DSA28的相關(guān)性分析

2.4 RA患者血清中SDC-2、VEGF的相關(guān)性 RA患者血清中SDC-2與VEGF呈正相關(guān)(r=0.498，P<0.01)。

3 討論

VEGF能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞黏附，形成新血管，并增加血管通透性[7]，是RA血管新生中最有效的促血管生成因子[1]。據(jù)報(bào)道[2,3]，VEGF主要由滑膜襯里層細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其在RA的滑膜組織及血清中表達(dá)明顯高于骨關(guān)節(jié)炎或其他形式的關(guān)節(jié)炎。在RA病程中，過量的促血管生成因子可促進(jìn)滑膜炎癥及骨和軟骨破壞[8]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9]，敲除RA小鼠的VEGF基因后，其病理學(xué)改變及滑膜血管新生明顯減輕。本研究結(jié)果表明，RA患者血清VEGF水平高于對(duì)照組，滑膜組織中VEGF表達(dá)高于OA患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示VEGF與RA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

多配體蛋白聚糖(SDC)屬Ⅰ型跨膜蛋白，包括SDC1-4四種亞型，其中SDC-2主要由血管中的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生成，能與不同的生長(zhǎng)因子結(jié)合參與血管形成[6,10]。此外，SDC2下調(diào)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)散、黏附和遷移影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管[11]。有研究證實(shí)，SDC-2在RA關(guān)節(jié)滑膜組織的血管內(nèi)高度表達(dá)[6]。本研究中，RA患者血清SDC-2水平高于對(duì)照組，滑膜組織中SDC-2表達(dá)高于OA患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SDC-2參與了RA血管新生過程，與RA的發(fā)病及病情進(jìn)展存在一定關(guān)系。

有實(shí)驗(yàn)證明[5]，脊椎動(dòng)物中VEGF與SDC-2通過基因表達(dá)在血管生成中存在相互作用。本研究分析了RA患者血清SDC-2與VEGF 水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者間呈正相關(guān)。表明在RA發(fā)病過程中，VEGF和SDC-2可能呈協(xié)同作用。RA滑膜血管新生機(jī)制可能通過VEGF及SDC-2介導(dǎo)。目前對(duì)于SDC-2在血管生成過程中與生長(zhǎng)因子相互作用的機(jī)制有以下設(shè)想:SDC-2的硫酸乙酰肝素鏈作為結(jié)合受體可直接與VEGF結(jié)合，從而調(diào)節(jié)VEGF在其受體附近的分布;SDC-2亦可作為共同受體，與VEGF及其受體形成信號(hào)復(fù)合物參與血管生成[5,12,13]，并影響RA進(jìn)程。

本研究結(jié)果表明，血清SDC-2、VEGF水平與ESR、CRP、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、DSA28評(píng)分等指標(biāo)呈正相關(guān),而與RF、MCV無相關(guān)性。Lee等[3]研究表明，VEGF水平不僅與ESR、CRP、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)呈正相關(guān)，且與RF呈正相關(guān)。研究間的差異可能是由于雖然RF可作為診斷RA的一個(gè)指標(biāo)，但其與疾病活動(dòng)的關(guān)系不大，且對(duì)于預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的價(jià)值仍有異議[14]。ESR、CRP、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、DSA28-CRP是判定疾病活動(dòng)的指標(biāo)，說明血清SDC-2、VEGF水平變化可作為臨床觀察RA病情活動(dòng)的參考指標(biāo)。

綜上所述，SDC-2、VEGF在RA血清和關(guān)節(jié)滑膜組織中高表達(dá)，且二者呈正相關(guān)；二者可作為臨床觀察RA病情活動(dòng)的參考指標(biāo)。