范佳佳， 盛繼露， 李曉紅， 張小平

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 蕪湖 241000)

從保護(hù)遺傳學(xué)角度來看，保護(hù)物種的遺傳和進(jìn)化潛力是其保護(hù)和復(fù)壯的重點。交配系統(tǒng)(mating system)是植物種群內(nèi)2代個體間遺傳聯(lián)系的有性系統(tǒng)，決定了其后代居群的基因型分布，與植物演化密切相關(guān)，對植物的分布、群體有效大小、遺傳結(jié)構(gòu)、基因流和選擇、種群演化等均有影響[1]，因此，深入了解植物的繁殖信息對遺傳育種方法選擇和植物保護(hù)策略制定具有重要的指導(dǎo)意義[2]。

青檀(PteroceltistatarinowiiMaxim.)隸屬于青檀屬(PteroceltisMaxim.)[3]，為中國特有的單種屬植物，雌雄同株異花，風(fēng)媒傳粉。該樹種雖然在中國溫帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布，但由于其對生長條件要求嚴(yán)格，再加上人為干擾的影響，現(xiàn)存種群多呈間斷島嶼狀分布[4]，種群數(shù)量和規(guī)模呈下降趨勢。目前，雖然關(guān)于青檀的研究較多[5-7]，但尚未見其交配系統(tǒng)類型方面的研究報道，不利于制定其有效保護(hù)策略。

SSR分子標(biāo)記已被廣泛用于植物交配系統(tǒng)研究[8]。作者利用12對多態(tài)性較高的SSR引物對山東棗莊青檀寺內(nèi)青檀自然居群的10個家系子代進(jìn)行了PCR擴增，在此基礎(chǔ)上對其交配模式進(jìn)行了分析，以期分析其交配系統(tǒng)的影響因子，預(yù)測其原位保護(hù)居群的生存風(fēng)險，從而為青檀的原位和異位保存以及其遺傳多樣性保持和繁育體系制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

在山東棗莊青檀寺內(nèi)的青檀自然居群中隨機選10株青檀作為母本，株距1～50 m；分別采集各母株飽滿成熟種子50～100粒，同株種子為1個家系，置于硅膠中帶回實驗室；采用變溫層積法[9]進(jìn)行催芽，種子發(fā)芽后移到花盆中；幼苗具5枚以上真葉時，采集所有葉片，置于硅膠中保存、備用。

1.2 方法

采用改良CTAB法[10]提取10個家系子代237株單株葉片的基因組DNA，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

利用12對多態(tài)性較高的SSR引物(表1)，采用TP-M13-SSR技術(shù)[11]進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。擴增體系總體積15.0 μL，包括模板DNA 2.5 ng、2.5 mmol·L-1dNTPs Mix 1.2 μL、25 μmol·L-1MgCl21.2 μL、10×PCR buffer (Mg2+Free)1.5 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL、10 μmol·L-1TP-M13熒光引物0.3 μL、10 μmol·L-1正向引物0.4 μL、10 μmol·L-1TP-M13反向引物0.1 μL，ddH2O補足體積。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s、72 ℃延伸30 s， 27個循環(huán)；95 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

將質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的擴增產(chǎn)物交上海點晶生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1用于青檀各家系葉片DNA擴增反應(yīng)的SSR引物序列及退火溫度

Table1SequenceandannealingtemperatureofSSRprimersusedforamplificationreactionofDNAfromleafofeachlineofPteroceltistatarinowiiMaxim.

引物編號No. of primer引物序列(5'→3') Primer sequence (5'→3')正向引物 Forward primer反向引物 Reverse primer退火溫度/℃Annealing temperatureQT-1CATATTTCCTCTTCCCCTAAACAGCTCACCCATACCTTC55QT-2CACCTTTGCTTACTCCCTGAATGTACTCGCTAATGAACC56QT-3AGCGACTGAGGGTTTCATGGCTTCTGCTCCGCCTTTCT62QT-4CAGGGCACTCCAATAGAATAGATGGTGCTGGGATGGGAAG60QT-5CATTTGGATACACCAGGAAGGCAGCCATTGATGCTTAGTCC60QT-6TCTAGGCTGTATAAAGGGACGATGAAGTAAATGGGGAATC54QT-7CATGTCACCATTACCGAACACACAGTAAGAAAACACACC55QT-8TGGCGATGTGAAGCCCTAAGTCATTTCAACGGTCAAGATTAC56QT-9CAATAATAGCCTTGCATCTCCTCCCTTTGAACAAACCTC56QT-10CCTGTCCAGCTACTAATTTGGTCTGCGATGGTATCTGTT56QT-11CAGGTCCAGAGGGAGAAACCCCAGGGTCAAATAGGTAAT60QT-12GCTTCCTTGGGTCTCATCCTCCACAGACGAGTAGTTCTCC56

1.3 數(shù)據(jù)分析

以LIZ500為內(nèi)標(biāo)，用GeneMarker軟件判讀擴增產(chǎn)物測序結(jié)果，獲得微衛(wèi)星基因型數(shù)據(jù)，并進(jìn)行人工校正。基于最大似然法，用MLTR v3.2軟件[12]計算交配系統(tǒng)參數(shù)，包括單位點異交率(ts)、多位點異交率(tm)、雙親近交系數(shù)(tm-ts)和親本近交系數(shù)(F)，重復(fù)取樣1 000次。假定條件：1)每個交配事件為隨機的遠(yuǎn)交(t)或自交(s=1-t)；2)異交率與母本基因型獨立；3)花粉庫與母本同質(zhì)；4)受精和子代基因型的檢測時間無選擇；5)各位點等位基因隨機分離。近交衰退值(δ)為1減去自交種子相對于異交種子的相對適合度，當(dāng)不同世代間的親本近交系數(shù)基本不變時，δ=1-2F·t/〔(1-t)·(1-F)〕。

2 結(jié)果和分析

實驗結(jié)果(表2)表明：供試10個青檀家系的雙親近交系數(shù)均值為0.028，大于0，表明該青檀自然居群存在一定的近交。

表2基于SSR分子標(biāo)記的青檀各家系的交配系統(tǒng)參數(shù)和近交衰退值

Table2MatingsystemparametersandinbreedingdepressionvalueofeachlineofPteroceltistatarinowiiMaxim.basedonSSRmolecularmarker

家系Line樣本數(shù)Number of sample單位點異交率Single-locusoutcrossing rate多位點異交率Multi-locusoutcrossing rate雙親近交系數(shù)Biparental inbreeding coefficient親本近交系數(shù)Parental inbreeding coefficient近交衰退值Inbreedingdepression valueQTS-1240.9421.0000.0580.027-0.099QTS-2241.1201.002-0.118-0.200-3.480QTS-3240.9691.0000.0310.129-6.024QTS-4240.6230.9290.306-0.2001.793QTS-5241.0861.000-0.0860.0762.774QTS-6240.7640.9810.217-0.2002.554QTS-7221.0280.957-0.071-0.153-11.953QTS-8240.9141.0000.0860.264-3.130QTS-9230.8821.0000.118-0.2004.588QTS-10241.2591.002-0.257-0.200-1.333均值Mean240.9590.9870.028-0.066-1.431

10個家系的單位點異交率和多位點異交率均較高，其中，家系QTS-2、QTS-5、QTS-7和QTS-10的多位點異交率低于單位點異交率，雙親近交系數(shù)小于0，說明這4個家系存在較高比例的異交；其余6個家系的多位點異交率高于單位點異交率，雙親近交系數(shù)大于0，說明這6個家系存在親緣關(guān)系較近個體間的異交，即存在程度較低的近交。家系QTS-2、QTS-4、QTS-6、QTS-7、QTS-9和QTS-10的親本近交系數(shù)小于0，說明這6個家系有過剩的雜合子，但缺少純合子，異交優(yōu)勢較大；而家系QTS-1、QTS-3、QTS-5和QTS-8的親本近交系數(shù)大于0，說明這4個家系有過剩的純合子，近交優(yōu)勢較大。雖然實際上世代間親本近交系數(shù)不變的情況不存在，但近交衰退值仍能在一定程度上反映各家系的近交衰退程度。計算結(jié)果顯示：家系QTS-4、QTS-5、QTS-6和QTS-9的近交衰退值較高，分別為1.793、2.774、2.554和4.588。

3 討論和結(jié)論

本研究結(jié)果表明：供試青檀自然居群各家系間存在一定的近交(雙親近交系數(shù)均值為0.028)，這可能是因為青檀的無性生殖能力較強，如根基萌蘗(克隆)，由此產(chǎn)生的個體可與母株交配，進(jìn)而提高自交比例。但是，供試青檀自然居群家系間單位點異交率和多位點異交率的均值均較高(分別為0.959和0.987)，這可能是家系間隨花粉傳播的較強基因流所致，并且，基因流取決于青檀典型的風(fēng)媒傳粉生物學(xué)特征(如先葉開花、雌雄同株異花、花藥伸出花被片、花粉粒輕且量大、雌蕊柱頭呈羽毛狀以及不具香味和蜜腺等)。供試青檀自然居群的親本近交系數(shù)均值為-0.066，小于0，說明該青檀自然居群的雜合子過剩。綜合上述研究結(jié)果及青檀的生物學(xué)特征，認(rèn)為青檀是以異交為主的樹種。近交衰退程度、授粉成本和交配機會是影響植物種群自交和異交程度的決定因子[13]，并且，較高的近交衰退可能使植物形成適應(yīng)近交的機制[14]。從生物學(xué)特征來看，單性花為青檀避免近交的機制，但雌雄同株卻導(dǎo)致這一機制不完全。在供試的10個青檀家系中，有4個家系的近交衰退值較高，因此，雖然該青檀自然居群的雜合子過剩，異交率較高，但是仍需對其各原位保護(hù)居群的遺傳多樣性進(jìn)行長期監(jiān)測。

總體來看，防止青檀種群衰退的重要途徑為防止近交。首先應(yīng)對已有種群開展原位保護(hù)，設(shè)立自然保護(hù)區(qū)，有效保護(hù)適宜青檀生長的石灰?guī)r生境，減少人為破壞和干擾；其次應(yīng)加強青檀造林技術(shù)研究和管理(如引種其他種群的青檀植株，人為加強各種群間的基因交流)，提高種群的遺傳多樣性和活力，最大限度地保存青檀的遺傳和進(jìn)化潛力；再次在引種育苗時廣泛收集青檀種子，建立優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源庫，盡量種植不同植株或種群的子代，從而更好地開展異地保護(hù)。