基于超高效液相色譜-電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜的川芎化學(xué)成分的快速分析

高 昕，孫文軍，岐 琳，李 延

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.西安新通藥物研究有限公司，西安 710077)

川芎ChuanxiongRhizoma為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。其味辛，性溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，主治胸痹心痛、頭痛、產(chǎn)后瘀滯腹痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲腫痛和風(fēng)濕痹痛等，是中醫(yī)常用處方藥之一[1]?！吨袊?guó)藥典》、原衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第1～20冊(cè)以及部分新藥標(biāo)準(zhǔn)中含川芎的中成藥達(dá)678個(gè)，川芎可謂常用傳統(tǒng)中藥之一。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的關(guān)鍵科學(xué)問題[2]。目前對(duì)其化學(xué)成分研究的報(bào)道主要采用HPLC-UV法[3-4]和HPLC-MS法[5-7]。徐曉芳等[8]采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)對(duì)川芎水提部位進(jìn)行化學(xué)成分分析，30 min色譜圖內(nèi)鑒定了13個(gè)成分。超高效液相色譜(UPLC)與傳統(tǒng)HPLC法相比具有更高的分離度、更快的分析速度和更大的峰容量等優(yōu)點(diǎn)。飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF/MS) 能夠測(cè)定離子峰簇的準(zhǔn)確質(zhì)量和同位素組成，結(jié)合精確質(zhì)量和同位素?cái)M合能夠準(zhǔn)確計(jì)算測(cè)定成分的分子式(元素組成)。電噴霧技術(shù)是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可使被測(cè)分子不發(fā)生熱降解，而以分子離子、準(zhǔn)分子離子、加合離子等形式進(jìn)入質(zhì)譜儀，有利于復(fù)雜混合物的物質(zhì)分析；檢測(cè)的同時(shí)還可通過(guò)提高源內(nèi)錐孔電壓使被測(cè)化合物在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞誘導(dǎo)裂解，產(chǎn)生碎片離子，有利于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[9]。本研究集合UPLC、ESI和TOF/MS優(yōu)越的色譜分離能力和質(zhì)譜高靈敏度、高分辨定性能力，利用UPLC-ESI-TOF/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，建立一種快速鑒定中藥化學(xué)物質(zhì)的方法，并以此方法鑒定川芎的化學(xué)成分，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及復(fù)方配伍研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀，Waters SynaptTMHigh Definition MS (HDMS) System質(zhì)譜分析系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；SCILOGEX臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX公司)；Eppendorf Research?plus移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)；KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試藥 乙腈，色譜純(德國(guó)Merck公司)；甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；甲酸為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；亮氨酸腦啡肽(美國(guó)Sigma公司)；綠原酸、阿魏酸、川芎嗪和當(dāng)歸內(nèi)酯A(購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1提取方法 取川芎藥材粗粉適量，加20倍量甲醇超聲提取2次，每次30 min。提取液于4 ℃以13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取1.2項(xiàng)下各對(duì)照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為1 mg·mL- 1的對(duì)照品溶液，備用。

2.3分析條件

2.3.1色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：A為1 mL·L-1甲酸水，B為1 mL·L-1甲酸乙腈;梯度洗脫程序?yàn)?～1.5 min，1%～16%B；1.5～5 min，16%～20%B；5～7 min，20%～25%B；7～10 min，25%～35%B;10～18 min，35%～88%B；柱溫預(yù)設(shè)：35 ℃；樣品倉(cāng)溫度預(yù)設(shè)：4 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正、負(fù)離子掃描分析。

2.3.2質(zhì)譜條件

2.3.2.1正離子模式 毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔采樣電壓：35 V；錐孔提取電壓：4.0 V；去溶劑氣溫度：300 ℃；去溶劑氣流量：800 L·h-1；離子源溫度：110 ℃；碰撞氣體：He；分子離子掃描碰撞能：6 V，MS/MS碰撞能：20～40 V。準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽(Leucine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1)溶液，校正溶液進(jìn)樣速度為100 μL·min-1，校正頻率為5 s；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。

2.3.2.2負(fù)離子模式 毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔采樣電壓：35 V；錐孔提取電壓：4.0 V；去溶劑氣溫度：300 ℃；去溶劑氣流量：800 L·h-1；離子源溫度：110 ℃；碰撞氣：He；分子離子掃描碰撞能6 V，MS/MS碰撞能20～40 V。準(zhǔn)確質(zhì)量校正采用亮氨酸-腦啡肽([M-H]-=554.261 5)溶液，校正溶液進(jìn)樣速度為100 μL·min-1，校正頻率為5 s；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。

2.4成分檢測(cè)與鑒定 檢索文獻(xiàn)[7，10-20]，建立川芎化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。取供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，采集UPLC-TOF/MS 色譜圖。分析各峰質(zhì)譜圖，找出化合物的分子離子峰，利用Masslynx V4.1軟件的Elemental Composition 計(jì)算工具，根據(jù)測(cè)量值與理論值的偏差小于2 ppm 和同位素?cái)M合度小于1.0的原則，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式即元素組成，在已建立的川芎化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)或在數(shù)據(jù)庫(kù)(Chemspider、PubMed和PubChem等)中檢索匹配化合物，然后對(duì)其MS/MS圖譜利用Mass Fragment功能分析各峰碎片離子，分析其裂解途徑。綜合分子式和多級(jí)碎片離子信息及相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)各峰進(jìn)行成分鑒別。其中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、川芎嗪和當(dāng)歸內(nèi)酯A用對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)。

3 結(jié)果與討論

3.1檢測(cè)條件的考察 影響質(zhì)譜檢測(cè)色譜條件主要是考察流動(dòng)相組成和洗脫梯度。流動(dòng)相考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水和乙腈-甲酸水，結(jié)果表明，在乙腈和水相中都加入甲酸可使基線更穩(wěn)定，同時(shí)色譜峰的對(duì)稱性提高；在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，流動(dòng)相中加入適量甲酸可增強(qiáng)結(jié)合氫離子成分的質(zhì)譜信號(hào)，同時(shí)降低該成分加鹽離子的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，從而簡(jiǎn)化質(zhì)譜圖，便于解析。經(jīng)反復(fù)優(yōu)化流動(dòng)相比例及變化的強(qiáng)度，確定了本研究所設(shè)的洗脫梯度，結(jié)果在18 min 即可實(shí)現(xiàn)對(duì)川芎化學(xué)成分的良好分離。質(zhì)譜條件考察了與離子的產(chǎn)生、傳輸和檢測(cè)有關(guān)的脫溶劑氣流量(700，750，800和850 L·h-1)、脫溶劑氣溫度(250，275，300和325 ℃)、離子源溫度(100，105，110和115 ℃)和毛細(xì)管電壓(2.5，2.7，3.0和3.2 kV)等對(duì)樣品的分析有較大影響的參數(shù)，優(yōu)化的質(zhì)譜條件為脫溶劑溫度：300 ℃；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣流量(N2)： 800 L·h-1；毛細(xì)管電壓：3.0 kV。

3.2樣品的檢測(cè)與鑒定 在正負(fù)電噴霧電離模式下分別測(cè)定了川芎藥材的UPLC-TOF/MS色譜圖，正負(fù)離子模式下均可檢測(cè)較多成分，苯酞類成分在正離子模式提供更多的結(jié)構(gòu)信息，酚酸類成分在負(fù)離子模式提供更多的結(jié)構(gòu)信息，因此分析兩類成分時(shí)分別以正、負(fù)離子模式為主，另一種為輔。正負(fù)離子模式下川芎藥材的UPLC-TOF/MS 基峰離子(BPI) 色譜圖見圖1。由圖1可知，該分析條件下川芎化學(xué)成分能夠得到較好的檢測(cè)。按照2.4項(xiàng)下方法對(duì)各色譜圖中各峰進(jìn)行定性鑒別。對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的川芎藥材所含化合物的信息進(jìn)行整理，結(jié)合川芎提取物UPLC-ESI-MS分析的基峰離子色譜圖，根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS分析系統(tǒng)的原理、特點(diǎn)及Masslynx液質(zhì)聯(lián)用工作站的相應(yīng)功能，對(duì)川芎基峰離子色譜圖中各色譜峰化合物開發(fā)了下列方法和過(guò)程：UPLC-MS/MS的分離分析平臺(tái)提供有關(guān)化合物的保留時(shí)間、精確質(zhì)量(m/z)和MS/MS數(shù)據(jù)，在化合物結(jié)構(gòu)鑒定中，利用TOF/MS方法測(cè)定誤差范圍內(nèi)(小于2 ppm)化合物的精確質(zhì)量，利用Masslynx液質(zhì)聯(lián)用工作站中的Elemental Composition功能得到相應(yīng)化合物元素組成和同位素峰相對(duì)豐度比與該元素組成的理論同位素峰相對(duì)豐度比的擬合度(i-FIT(Norm))，根據(jù)同位素?cái)M合度可進(jìn)一步縮小分子式匹配范圍。通過(guò)元素組成或分子式檢索化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(自建的川芎數(shù)據(jù)庫(kù)或網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)如ChemSpider、PubMed和PubChem等)，得到可能的化合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合測(cè)得的MS/MS數(shù)據(jù)利用Masslynx液質(zhì)聯(lián)用工作站中的Mass Fragment功能進(jìn)行離子碎片分析及匹配，篩選出最有可能的一種或幾種化合物，最終通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比色譜、質(zhì)譜行為、相應(yīng)文獻(xiàn)參考或數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定化合物的結(jié)構(gòu)。如川芎UPLC-TOF/MS 色譜圖中峰4 的分子離子193[M-H]-的m/z為193.050 4，見圖2。經(jīng)Masslynx V4.1 軟件的Elemental Composition工具計(jì)算，與理論值比較的偏差小于2 ppm 范圍內(nèi)給出至少1個(gè)元素組成，進(jìn)一步根據(jù)同位素?cái)M合度小于1.0 的原則，確定分子式為C10H9O4。該元素組成同位素?cái)M合度為0.02，綜合準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定和同位素?cái)M合度確定該峰的唯一元素組成為C10H9O4。利用Mass Fragment進(jìn)一步分析該峰的子離子碎片，m/z178為分子離子峰脫去1個(gè)甲基(-CH3)的碎片離子，碎片m/z149為分子離子峰脫去1個(gè)羧基(-COOH)，碎片m/z134為m/z149脫去1個(gè)甲基，也可由m/z178脫去1個(gè)羧基形成，見圖3[21]。在川芎化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中能夠檢索到與該峰分子式相匹配的化合物，為阿魏酸，其裂解規(guī)律與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致。與對(duì)照品進(jìn)行色譜比對(duì)，確定該峰為阿魏酸。采用上述方法，對(duì)川芎UPLC-OF/MS 色譜圖中的30個(gè)峰進(jìn)行了鑒定或結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果見表1。峰5，6，7和9為同分異構(gòu)體，m/z515，m/z353和m/z191分別為分子離子峰、脫咖啡酸(162 Da)和脫2個(gè)咖啡酸的碎片離子，在數(shù)據(jù)庫(kù)中有多個(gè)與之匹配的化合物，為二咖啡?？崴犷惢衔颷22]，取代基的連接位置不能確定，這里僅進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

表1川芎藥材UPLC-ESI-Q-TOF-MS色譜峰鑒定結(jié)果

Tab.1 Identification results of chromatographic peaks ofChuanxiongRhizomaby UPLC-ESI-Q-TOF-MS

序號(hào)保留時(shí)間/min化合物名稱相對(duì)分子質(zhì)量/Da分子式理論值(m/z)實(shí)測(cè)值 (m/z)誤差/ppm碎片離子1*2.64chlorogenic acid354.095 1C16H18O9353.087 2353.086 9-0.8353[M-H]-,191[M-H-C9H6O3]-2*3.05caffeic acid180.042 3C9H8O4179.034 4179.034 1-1.6179 [M-H]-3*2.85ligustrazine136.100 1C8H12N2135.092 2135.092 2-1.5135 [M-H]-4*4.49ferulic acid194.057 9C10H10O4193.050 1193.050 41.6193[M-H]-,178[M-H-CH3]-,149[M-H-CO2]-,134[M-H-CH3-CO2]-5 4.92dicaffeoylquini-cacid516.126 8C25H24O12515.119 0515.118 7-0.6515[M-H]-,353[M-H-C9H6O3]-,191[M-H-2C9H6O3]-6 5.32dicaffeoylquini-cacid516.126 8C25H24O12515.119 0515.118 0-1.9515[M-H]-,353[M-H-C9H6O3]-,191[M-H-2C9H6O3]-7 5.45dicaffeoylquini-cacid516.126 8C25H24O12515.119 0515.118 9-0.2515[M-H]-,353[M-H-C9H6O3]-,191[M-H-2C9H6O3]-8 5.77senkyunolide J226.120 5C12H18O4209.117 8209.117 4-1.9249[M+Na]+,209[M+H-H2O]+,191[M+H-2H2O]+,163[M+H-H2O-C3H6]+,145[M+H-2H2O-CO2]+9 6.35dicaffeoylquini-cacid516.126 8C25H24O12515.119 0515.118 1-1.7515[M-H]-,353[M-H-C9H6O3]-,191[M-H-2C9H6O3]-10 7.25senkyunolide I224.104 9C12H16O4207.102 1207.101 8-1.4247[M+Na]+,225[M+H]+,207[M+H-H2O]+,189[M+H-2H2O]+,179[M+H-H2O-CO]+,165[M+H-H2O-C3H6]+,145[M+H-2H2O-CO2]+

表1(續(xù))川芎藥材UPLC-ESI-Q-TOF-MS色譜峰鑒定結(jié)果

Tab.1(Continued) Identification results of chromatographic peaks ofChuanxiongRhizomaby UPLC-ESI-Q-TOF-MS

序號(hào)保留時(shí)間/min化合物名稱相對(duì)分子質(zhì)量/Da分子式理論值(m/z)實(shí)測(cè)值(m/z)誤差/ppm碎片離子117.54apigenin-7-O-β-D-glueuronide446.084 9C21H18O11447.092 7447.092 5-0.5447[M+H]+,271[M+H-GluA]+127.78senkyunolide H224.104 9C12H16O4207.102 1207.101 9-1.0247[M+Na]+,225[M+H]+,207[M+H-H2O]+,189[M+H-2H2O]+,179[M+H-H2O-CO]+,165[M+H-H2O-C3H6]+139.91senkyunolide D222.089 2C12H14O4221.081 4221.081 0-1.8223[M+H]+,205[M+H-H2O]+,221[M-H]-,177[M-H-CO2]-1411.04apigenin270.052 8C15H10O5271.060 5271.060 3-0.7271[M+H]+,269[M-H]-1511.48senkyunolide G208.109 9C12H16O3207.102 1207.101 9-0.9232[M+Na]+,209[M+H]+,191[M+H-H2O]+,207[M-H]-,163[M-H-CO2]-1612.023-butylene-4,5-dihydroxyph-thalide220.073 6C12H12O4219.064 9219.065 31.8219[M-H]-1712.57senkyunolide F206.094 3C12H14O3207.102 1207.101 8-1.4207[M+H]+,189[M+H-H2O]+,179[M+H-CO]+,161[M+H-CO-H2O]+,133[M+H-2CO-H2O]+1813.50senkyunolide A192.115 1C12H16O2193.122 8193.122 6-1.0193[M+H]+,175[M+H-H2O]+,147[M+H-H2O-CO]+,137[M+H-C4H8]+1913.723-butylphthalide190.099 4C12H14O2191.107 2191.107 0-1.0191[M+H]+,173[M+H-H2O]+,145[M+H-H2O-CO]+2014.21E-ligustilide190.099 4C12H14O2191.107 2191.107 1-0.5191[M+H]+,173[M+H-H2O]+,155[M+H-2H2O]+2114.37E-butylideneph-thalide188.083 7C12H12O2189.091 6189.091 91.6189[M+H]+,171[M+H-H2O]+,153[M+H-2H2O]+,128[M+H-H2O-CO-CH3]+,115[M+H-H2O-CO-C2H4]+2214.58Z-ligustilide190.099 4C12H14O2191.107 2191.107 1-0.5191[M+H]+,173[M+H-H2O]+,163[M+H-CO]+,155[M+H-2H2O]+,149[M+H-C3H6]+,145[M+H-H2O-CO]+,117[M+H-H2O-CO-C2H4]+,105[M+H-H2O-CO-C3H4]+,91[M+H-H2O-CO-C4H6]+2314.67Z-butylideneph-thalide188.083 7C12H12O2189.091 6189.091 70.5189[M+H]+,171[M+H-H2O]+,153[M+H-2H2O]+,128[M+H-H2O-CO-CH3]+,115[M+H-H2O-CO-C2H4]+2415.97Z-6,8'7,3'-diligustilide380.198 8C24H28O4381.206 6381.206 4-0.5403[M+Na]+,381[M+H]+,335[M+H-HCOO]-,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+,145[M+H-H2O-CO]+,117[M+H-H2O-CO-C2H4]+,105[M+H-H2O-CO-C3H4]+,91[M+H-H2O-CO-C4H6]+2516.77riligustilide380.198 8C24H28O4381.206 6381.206 1-1.3403[M+Na]+,381[M+H]+,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+2616.86tokinolide B380.198 8C24H28O4381.206 6381.206 0-1.6403[M+Na]+,381[M+H]+,335[M+H-HCOO]-,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+27*16.96levistolide A380.198 8C24H28O4381.206 6381.206 5-0.3403[M+Na]+,381[M+H]+,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+,163[C12H15O2-CO]+,155[C12H15O2-2H2O]+,145[C12H15O2-CO-H2O]+,135[C12H15O2-CO-C2H4]+2817.43senkyunolide P382.214 4C24H30O4383.222 2383.221 7-1.3405[M+Na]+,383[M+H]+,365[M+H-H2O]+,355[M+H-CO]+,191[C12H15O2]+2917.70Z,Z'-6,6'7,3'a-diligustilide380.198 8C24H28O4381.206 6381.206 3-0.8403[M+Na]+,381[M+H]+,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+,3017.823',6,8',3a-diligustilide380.198 8C24H28O4381.206 6381.205 8-2.0403[M+Na]+,381[M+H]+,191[C12H15O2]+,173[C12H15O2-H2O]+

注:*表示與對(duì)照品對(duì)照。

圖1川芎藥材的UPLC-ESI-TOF/MS基峰離子色譜圖(BPI)

A.負(fù)離子模式;B.正離子模式。

Fig.1 UPLC-MS base peak intensity chromatograms ofChuanxiongRhizoma(BPI)

A.negative mode；B.positive mode.

圖2川芎藥材UPLC-ESI-TOF/MS色譜圖峰4(阿魏酸)的質(zhì)譜圖

Fig.2 Mass fragment information of ferulic acid fromChuanxiongRhizomain negative mode

圖3阿魏酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律

Fig.3 Proposed fragmentation pathway of ferulic acid

分析結(jié)果表明，飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得質(zhì)量偏差小于2 ppm 的離子質(zhì)量，測(cè)得離子的同位素?cái)M合度幾乎均為0，這表明各化合物測(cè)定的同位素峰豐度比幾乎與理論值一致，從而能夠明顯與其他分子式進(jìn)行區(qū)別。結(jié)合精確質(zhì)量測(cè)定和同位素?cái)M合度分析，能夠計(jì)算出唯一的分子式。為川芎及其復(fù)方配伍的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。本文應(yīng)用UPLC-ESI-TOF/MS技術(shù)分析川芎的化學(xué)成分，表明該方法快速、有效、準(zhǔn)確，為其他中藥化學(xué)成分的研究提供了分析方法。