提高小兒鹽酸賴氨酸顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

羅 立，但曉夢

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢 430064)

小兒鹽酸賴氨酸顆粒主要改善兒童發(fā)育不良、食欲不振；能促進兒童生長發(fā)育及智力發(fā)展、提高機體免疫力；具有促進神經(jīng)細胞的再生與代謝、提高腦組織的生理功能，用于顱腦損傷及其綜合征[1-2]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)第九冊，標(biāo)準(zhǔn)號WS-10001-(HD-0793)-2002[3]，該標(biāo)準(zhǔn)中檢查項存在缺項，且現(xiàn)有含量測定方法專屬性不強，不能準(zhǔn)確測定主藥含量的問題。

WS-10001-(HD-0793)-2002中含量測定方法采用非水滴定法[3]測定鹽酸賴氨酸含量，該方法存在以下問題：①專屬性不強、靈敏度不高；②實驗過程中所用的醋酸汞會對環(huán)境造成污染，不環(huán)保；③非水滴定法測得的鹽酸賴氨酸含量普遍偏低，原因可能是由于加熱時間較長，鹽酸賴氨酸部分分解造成[4]。有文獻推薦采用可見分光光度法測定鹽酸賴氨酸的含量[5]，該法僅采用茚三酮試劑與鹽酸賴氨酸中的氨基反應(yīng)，通過顯色反應(yīng)測定其吸光度值，專屬性不強。也有文獻推薦采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定鹽酸賴氨酸含量[6]，但采用ELSD測定鹽酸氨基葡萄糖時，基線不平，儀器耐用性不好，且流動相選擇受限，使得藥物與其成鹽離子分離度不高，從而不利于藥物的含量檢測。此外，蒸發(fā)光散射檢測器較為昂貴，實際推廣應(yīng)用范圍受限，同時采用高純氮氣作為霧化氣體，產(chǎn)生的廢氣也會對空氣造成污染。

鑒于鹽酸賴氨酸無特征紫外吸收波長，本實驗采用HPLC異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定小兒鹽酸賴氨酸顆粒的含量[7-10]，引入生色基團法專屬性強，且能同時實現(xiàn)鹽酸賴氨酸與其他氨基酸分離，可用于小兒鹽酸賴氨酸顆粒的質(zhì)量控制。本文通過對小兒鹽酸賴氨酸顆粒的鑒別項和檢查項進行研究，草擬其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHG-9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；Waters 2695 Alliance高效液相色譜儀，包括柱溫箱、在線真空脫氣機、2487紫外檢測器以及Empower色譜工作站(美國Waters公司)。

1.2試藥 鹽酸賴氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號624-201104)；鹽酸賴氨酸原料藥(批號20130317)，小兒鹽酸賴氨酸顆粒(貴州益佰制藥股份有限公司，批號：130501，130502，130503)；乙腈為色譜純，茚三酮、醋酸鈉、醋酸、異硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基正己酸、三乙胺和正己烷均為分析純；水為超純水。

0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈試液和1 mol·L-1三乙胺乙腈試液均為臨用現(xiàn)配。

2 定性分析

2.1性狀 收集的3批樣品均為淡黃色可溶顆粒，符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2鑒別

2.2.1茚三酮鑒別反應(yīng) 分別取3批樣品4 g，加水15 mL，振搖使溶解，取溶液5 mL，加茚三酮2 mg，加熱，供試品溶液加入茚三酮后溶液顯紫色，均呈正反應(yīng)，符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2.2氯化物鑒別反應(yīng) 取3批樣品各適量，按照《中國藥典》2015年版四部通則對3批樣品的供試品溶液進行測定，均呈正反應(yīng)，符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2.3增加HPLC鑒別 由于擬定標(biāo)準(zhǔn)中采用HPLC法測定含量，故增訂HPLC鑒別：在含量測定項下記錄的色譜圖中，賴氨酸峰的保留時間與其對照品峰的保留時間一致。3批樣品中供試品溶液和對照品溶液的主峰保留時間均為39.7 min，保持一致。

2.3檢查

2.3.1增加其他氨基酸 參照《中國藥典》2015年版二部鹽酸賴氨酸原料其他氨基酸項下，補充了部分實驗，修訂了供試品溶液的質(zhì)量濃度，增加了系統(tǒng)適用性實驗，并比較了不同展開劑比例條件下鹽酸賴氨酸的比移值(Rf)。

取本品適量，加水溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為15 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。另取鹽酸賴氨酸對照品與精氨酸對照品各適量，置于同一量瓶中，用水溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適用性實驗溶液。按照TLC法實驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，采用2種展開劑：正丙醇-濃氨溶液(2∶1)和正丙醇-濃氨溶液(10∶9)，展開，晾干，在100 ℃干燥10 min，放冷，噴以茚三酮的丙酮溶液(1→50)，在80 ℃加熱至斑點出現(xiàn)，立即檢視。結(jié)果表明，調(diào)整展開劑的比例能夠增加鹽酸賴氨酸的Rf值，但無論是賴氨酸還是精氨酸的斑點均擴散較嚴(yán)重，邊緣模糊。因此仍保持展開劑的比例為正丙醇-濃氨溶液(2∶1)，在此比例下，采用硅膠G薄層板(手工鋪板)，鹽酸賴氨酸的Rf值為0.38，符合《中國藥典》2015年版四部通則中對Rf值的規(guī)定。對照品溶液顯一個清晰的斑點，系統(tǒng)適用性實驗溶液顯2個完全分離的斑點，3批樣品的供試品溶液所顯斑點顏色與對照溶液的主斑點比較，結(jié)果為淺，符合規(guī)定。

2.3.2干燥失質(zhì)量 收集的3批樣品在105 ℃干燥3 h，減失質(zhì)量依次為8，8和7 mg·g-1，均未超過20 mg·g-1，符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

3 含量測定

3.1色譜條件 色譜柱：Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用稀醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.4)為流動相A，乙腈為流動相B，水為流動相C，梯度洗脫程序見表1；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 The gradient elution procedure

時間/minA,0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液/%B,乙腈/%C,水/%09550295501980155305933839080204408020

3.2溶液的制備

3.2.1內(nèi)標(biāo)溶液 取6-氨基正己酸適量，加水使溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

3.2.2供試品溶液 精密稱取本品細粉適量(相當(dāng)于鹽酸賴氨酸20 mg)，置于50 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.3對照品溶液 精密稱取鹽酸賴氨酸對照品20 mg，置于50 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.4空白溶液 按照貴州益佰制藥股份有限公司提供的處方，配制不含主藥的空白溶液。

3.3衍生和測定方法 量取3.2項下制備的供試品溶液、對照品溶液和空白溶液各200 μL，分別加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液100 μL和0.1 mol·L-1的異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫避光放置1 h，再分別加入600 μL的正己烷，振蕩，靜置，分別取下層液2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按照內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算含量。

3.4方法學(xué)考察

3.4.1系統(tǒng)適用性實驗 精密量取上述3種溶液各2 μL，按照3.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖?？瞻兹芤簩y定無干擾，內(nèi)標(biāo)6-氨基正己酸(Rt=25.3 min)與鹽酸賴氨酸(Rt=39.7 min)有效分離，色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.空白溶液；B.對照品；C.供試品；1.內(nèi)標(biāo)；2.鹽酸賴氨酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.blank solution；B.reference substance；C.sample；1.internal standard；2.lysine hydrochloride.

3.4.2線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸賴氨酸對照品適量，用水稀釋至質(zhì)量濃度為7.46 mg·mL-1，作為儲備液，精密量取上述儲備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，精密加入3.2.1項下制備的內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，用水稀釋成鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度分別為0.373，0.746，1.492，2.238，2.984和3.730 mg·mL-1的溶液。分別精密量取上述溶液200 μL，按照3.3項下方法進行衍生，按照3.1項下色譜條件測定峰面積。以主峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進行線性回歸。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度在0.373～3.730 mg·mL-1范圍內(nèi)與比值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=1.298 3x+0.032 7(r=0.999 3)。

3.4.3精密度實驗 精密稱取鹽酸賴氨酸原料，置于50 mL量瓶中，加入3.2.1項下制備的內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，加水定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的溶液，搖勻。取該溶液200 μL，按照3.3項下方法進行衍生，取下層液2 μL，注入高效液相色譜儀，在規(guī)定波長處連續(xù)進樣6次，其RSD值為0.4%，結(jié)果表明，該方法精密度較好。

3.4.4重復(fù)性實驗 取同一批供試品(批號130501)6份，按照3.2.2項下方法制備供試品溶液，取200 μL，按照3.3項下方法進行衍生，取下層液2 μL注入高效液相色譜儀，進樣測定，按照內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算鹽酸賴氨酸含量，其RSD值為0.2%(n=6)，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

3.4.5回收率實驗 按照貴州益佰制藥處方比例分別稱取鹽酸賴氨酸原料藥與空白輔料適量，按照處方配制成含鹽酸賴氨酸80%，100%和120% 3種不同的9份模擬樣品，按照3.1項下色譜條件進行測定；另取2份不加輔料的鹽酸賴氨酸原料藥作為對照，同法測定，計算樣品回收率。結(jié)果平均回收率為100.5%，RSD值為0.7%(n=9)，見表2。

表2小兒鹽酸賴氨酸顆?；厥章蕦嶒灲Y(jié)果

Tab.2 Recovery results of lysine hydrochloride

編號加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%80%10.023 010.022 9599.74100.50.720.023 900.024 07100.7130.022 900.022 95100.22100%40.031 430.031 3399.6850.025 710.025 93100.8660.030 890.031 33101.42120%70.033 870.034 24101.0980.034 070.033 9499.6290.033 890.034 24101.03

3.4.6穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液200 μL，按照3.3項下方法進行衍生，取衍生后的供試品溶液適量，在室溫下放置，分別于0，2，4，6和8 h取下層液2 μL，注入液相色譜儀，測得RSD值為0.7%，結(jié)果顯示，衍生后的供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5樣品測定 本實驗共收集到3批小兒鹽酸賴氨酸顆粒。精密稱取各批樣品粉末適量，按照3.2.2項下方法配制供試品溶液，每批樣品各制備2份，依法進樣測定，每份樣品重復(fù)進樣2次，計算鹽酸賴氨酸的含量，結(jié)果批號分別為130501,130502和130503的樣品含量分別為100.3%，98.9%和98.5%，在標(biāo)示量90.0%～100.0%范圍內(nèi)，結(jié)果均符合規(guī)定。

4 討論

4.1色譜方法的建立

4.1.1色譜柱考察 本次實驗分別考察了Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Inersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱[11-13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種色譜柱的分離效果均較好，考慮到分析成本和色譜柱的普適性，建議采用常用十八烷基硅膠鍵合色譜柱。

4.1.2梯度洗脫條件考察 本次實驗采用的流動相為流動相A[醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH值為6.4)]、流動相B(乙腈)和流動相C(水)的梯度洗脫體系，并對梯度洗脫程序進行了優(yōu)化，考慮到各色譜峰的保留時間和各色譜峰分離度影響，最終確定正文中所述梯度洗脫條件。流動相A中采用稀醋酸調(diào)節(jié)0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液pH值至6.4時，鹽酸賴氨酸與其臨近的色氨酸峰分離度較好，且在pH值為6.4的條件下使用能保證色譜柱的使用壽命，提高方法的耐用性。

4.2衍生試劑的選擇 氨基酸HPLC檢測分析常用的衍生化試劑主要有異硫氰酸苯酯、2，4-二硝基氟苯、鄰苯二甲醛、萘二甲醛和氨基苯甲酯類等[14-20]，由于異硫氰酸苯酯和氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)物苯基硫酸鹽-氨基酸穩(wěn)定性較好，且采用紫外檢測儀進行檢測，可滿足國內(nèi)大多數(shù)藥品生產(chǎn)企業(yè)的檢驗條件。以異硫氰酸苯酯為柱前衍生劑的氨基酸分析方法具有反應(yīng)速度快、產(chǎn)物單一穩(wěn)定，與一級、二級氨基均可反應(yīng)等特點，使得衍生物在紫外檢測器下有較高的靈敏度，故推薦采用異硫氰酸苯酯作為本次實驗的衍生試劑。

小兒鹽酸賴氨酸顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用非水滴定法測定鹽酸賴氨酸含量，該法專屬性不強且會對環(huán)境造成污染，擬定的方法所用儀器耗材通用，能滿足國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)檢測條件，是一種較為理想的分析方法。