劉澤雨 龍姍姍 楊永長(zhǎng) 黃湘寧 喻華

(1.金堂縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，四川 成都 610499； 2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 四川 成都 610072)

兒童由于免疫功能尚未健全，較易受到外部一些致病性較強(qiáng)的病原體侵襲，引起呼吸道和腸道感染等常見(jiàn)感染性疾病[1]。細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒、念珠菌等均可引起兒童感染，其中以細(xì)菌感染居多。近年來(lái)由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性不斷上升，且部分細(xì)菌多重耐藥檢出率較高，給臨床治療帶來(lái)難度，為及時(shí)有效地治療兒科患者，指導(dǎo)臨床合理用藥，減少耐藥菌的產(chǎn)生，本文對(duì)2016年1月1日～2017年12月31日四川省人民醫(yī)院兒科住院細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果的863例患者的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察菌種構(gòu)成比及耐藥分布，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 為2016年1月1日～2017年12月31日四川省人民醫(yī)院普內(nèi)兒科、兒童重癥科、血液病兒科住院患者送檢的各類合格標(biāo)本。

1.2 培養(yǎng)及鑒定 按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版標(biāo)準(zhǔn)操作，大便標(biāo)本接種血平板、麥康凱平板、SS平板，其它標(biāo)本均接種血平板、麥康凱平板、沙保羅平板(SDA)、沙保氏葡萄糖瓊脂平板(含氯霉素，SGC)，下呼吸道標(biāo)本及腦脊液增加接種嗜血桿菌巧克力平板(接種所用平板除SGC為法國(guó)梅里埃生產(chǎn)外，其他平板均為鄭州安圖生產(chǎn)，β-內(nèi)酰胺酶試劑為重慶龐通公司生產(chǎn))。將平板細(xì)菌放置35℃5%～10%CO2環(huán)境培養(yǎng)18～48h(無(wú)菌部位標(biāo)本無(wú)菌生長(zhǎng)放置72h),念珠菌SDA37℃、SGC28℃環(huán)境培養(yǎng)18～72h(無(wú)菌生長(zhǎng)放置7d)[2]，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)42d,血培養(yǎng)采用法國(guó)梅里埃BacT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀37℃培養(yǎng)1～7d。培養(yǎng)標(biāo)本同時(shí)作一般細(xì)菌涂片染色(體液標(biāo)本離心用沉渣作一般細(xì)菌涂片染色),鏡檢觀察上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、細(xì)菌、念珠菌分布情況并以此判斷標(biāo)本是否合格。鑒定采用法國(guó)梅里埃ViTEK-2細(xì)菌鑒定儀及配套試劑板條進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定及藥敏分析，流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、念珠菌以法國(guó)梅里埃ATB-Expression及配套試劑進(jìn)行藥敏分析，法國(guó)梅里埃VITEK-MS質(zhì)譜儀作疑難菌鑒定。

1.3 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)方法和結(jié)果判讀參照2017美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀和報(bào)告，藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控使用大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、肺炎鏈球菌(ATCC49619)、流感嗜血桿菌(ATCC49247)、腸球菌(ATCC29212)、白色念珠菌(ATCC90028)均來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè) 采用頭孢硝噻吩試驗(yàn)定性檢測(cè)流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌中的β-內(nèi)酰胺酶，按CLSI推薦的紙片法篩選和酶抑制劑確診試驗(yàn)檢測(cè)腸桿菌科中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 兒科住院患者細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌株種類在標(biāo)本中的分布 2016年398株，2017年465株，總共863株，以痰液為主，共747株(86.6%)，其次為血液，共61株(7.1%)。痰液主要為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌以及腸桿菌科細(xì)菌，血液主要為凝固酶陰性葡萄球菌、腸桿菌科細(xì)菌，見(jiàn)表1。

表1 863株菌株在標(biāo)本中的分布(n，×10-2) Table 1 Distribution of 863 Strains in specimens

2.2 腸桿菌科細(xì)菌、凝固酶陰性葡萄球菌在標(biāo)本中的分布 腸桿菌科細(xì)菌以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌為主，主要分布在痰液、血液標(biāo)本中，大便標(biāo)本以鼠傷寒沙門菌為主；凝固酶陰性葡萄球菌主要分布在血液，以表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌為主，見(jiàn)表2、3。

2.3 流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌藥敏結(jié)果 兩種菌株對(duì)頭孢噻肟、氯霉素、氧氟沙星、利福平、四環(huán)素的敏感率>85%，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛敏感，均對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥，見(jiàn)表4。

表2 腸桿菌科細(xì)菌在標(biāo)本中的分布(n)Table 2 Distribution of enterobacteriaceae bacteria in specimens

表3 凝固酶陰性葡萄球菌在標(biāo)本中的分布(n)Table 3 Distribution of coagulase-negative staphylococci in specimens

表4 流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌藥敏結(jié)果(n，×10-2)Table 4 Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis susceptibility results

2.4 肺炎鏈球菌藥敏結(jié)果 238株均為非腦膜炎型，對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氯霉素類的敏感率>85%，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、復(fù)方新諾明耐藥，見(jiàn)表5。

2.5 金黃色葡萄球菌(SA)和凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)藥敏結(jié)果 葡萄球菌屬對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、替加環(huán)素的敏感率為100%，對(duì)氟喹諾酮類、慶大霉素、利福平、四環(huán)素敏感，對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素耐藥，見(jiàn)表6。

表5 肺炎鏈球菌藥敏結(jié)果(n，×10-2)Table 5 Streptococcus pneumoniae drug sensitivity results

表6 SA和CNS藥敏結(jié)果(n,×10-2)Table 6 Staphylococcus aureus (SA) and Coagulase-negative Staphylococci (CNS) Susceptibility Results

2.6 主要腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果 大腸埃希菌(E.Coli)、肺炎克雷伯菌(KPN)對(duì)頭孢霉素類、碳青酶烯類、阿米卡星、替加環(huán)素的敏感率>80%，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、妥布霉素、氟喹諾酮類敏感,對(duì)青霉素類、三代頭孢菌素類、四環(huán)素均耐藥。陰溝腸桿菌(E.cloacae)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、替加環(huán)素、氟喹諾酮類、碳青酶烯類敏感,對(duì)頭飽霉素類、青霉素類、復(fù)方新諾明耐藥，見(jiàn)表7。

2.7 兒科住院患者分離多重耐藥菌分布 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA):25.6%(22/86株)；耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)：78.1%(25/32株)，青霉素耐藥肺炎鏈球菌(PRSP )：2.1%(5/238株)；腸桿菌科產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)：大腸埃希菌12株，檢出率為50.0%，肺炎克雷伯菌15株，檢出率為45.5%，陰溝腸桿菌5株，檢出率為45.5%，粘質(zhì)沙雷菌1株，檢出率為20%，腸桿菌科ESBLs總檢出率為39.3%(33/84株)；腸桿菌科產(chǎn)碳青酶烯酶類(CRE)：肺炎克雷伯菌4株，陰溝腸桿菌3株，腸桿菌科CRE總檢出率為8.3%(7/84株)，見(jiàn)圖1。

表7 主要腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果(n，×10-2)Table 7 The bacterial susceptibility of major Enterobacteriaceae

圖1 兒科住院患者分離多重耐藥菌分布Figure 1 Distribution of multiple drug-resistant bacteria isolated from pediatric inpatients

3 討論

本研究結(jié)果顯示,兒科住院患兒主要以社區(qū)獲得性的流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌感染為主，其次為金黃色葡萄球菌、腸桿菌科細(xì)菌，與國(guó)內(nèi)雷旻報(bào)道一致[1]，與部分報(bào)道不一致[3-5],這可能與醫(yī)院收治病人疾病種類以及疾病嚴(yán)重程度有關(guān),部分報(bào)道以腸桿菌科細(xì)菌為主，而苛養(yǎng)菌如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌的檢出比例較低。本研究?jī)嚎撇∪艘钥琉B(yǎng)菌感染為主，微生物工作者應(yīng)重視兒科苛養(yǎng)菌的分離與鑒定。

培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果主要標(biāo)本來(lái)源為痰標(biāo)本，以社區(qū)獲得性感染菌為主；其次為血液，主要為凝固酶陰性葡萄球菌，以表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌為主，在血液標(biāo)本檢出菌種中的比例較高，占49.2%(30/61例)。表皮葡萄球菌既是常見(jiàn)皮膚污染菌，也是重要的導(dǎo)管相關(guān)血流感染(CRBSI)病原菌，此類菌株的檢出應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他感染指標(biāo)，如降鈣素原(PCT)、 C反應(yīng)蛋白(CRP)、 白細(xì)胞(WBC))、陽(yáng)性報(bào)警瓶數(shù)、陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間(TTP)、影像學(xué)資料等判斷是否是引起感染病原菌。本研究檢出表皮葡萄球菌按照上述判斷原則，血液標(biāo)本檢出表皮葡萄球菌TTP<16h感染， TTP>20h 污染為參考標(biāo)準(zhǔn)，以及根據(jù)血流感染(BSI)判斷標(biāo)準(zhǔn)、污染判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，結(jié)合多次送檢(特別是血液兒科)結(jié)果綜合判斷是否為病原菌，并積極與臨床溝通，要求臨床應(yīng)正確、規(guī)范采取血液培養(yǎng)標(biāo)本，避免污染。

流感嗜血桿菌是一種只侵犯人類的革蘭陰性桿菌，為兒童社區(qū)獲得性感染的首位病原菌，來(lái)自呼吸道及腦脊液標(biāo)本，對(duì)抗菌藥物的敏感性與申美靜等報(bào)道一致[7]，對(duì)紅霉素、夫西地酸天然耐藥。本研究檢測(cè)的流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株檢出率為60.9%，高于2016年全國(guó)平均水平(28.3%)[8]和國(guó)內(nèi)雷旻報(bào)道的45.74%[1]。肺炎鏈球菌來(lái)自呼吸道、血液及膿液標(biāo)本，全部為非腦膜炎型,在陽(yáng)性菌中最為多見(jiàn)，與國(guó)內(nèi)報(bào)道較一致[1,9]，可引起嚴(yán)重的肺部感染，甚至膿胸、敗血癥、腦膜炎等，最常見(jiàn)的肺炎鏈球菌血清型為血清型5[10]，未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素、利奈唑胺菌株，出現(xiàn)少數(shù)耐氟喹諾酮類菌株，青霉素耐藥肺炎鏈球菌(PRSP)檢出率2.1%，與張艷報(bào)道的44.43%[11]，李海燕報(bào)道的75.5%[12]，葉滿報(bào)道的67.65%、64.63%、80.22%[13]不一致，低于2016年全國(guó)平均水平(3.1%)[8]。肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥率達(dá)到90.2%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的一致[4-5,13]，已不適于肺炎鏈球菌的治療用藥。肺炎鏈球菌中有部分粘液型，對(duì)大多數(shù)抗生素敏感，但其粗厚的莢膜具有抗吞噬、粘附、抗抗生素等作用，具有較強(qiáng)的致病性，應(yīng)密切關(guān)注其抗生素的臨床療效?？ㄋ鷮?duì)抗菌藥物的敏感性與李振國(guó)報(bào)道的(除利福平外)一致[14],對(duì)甲氧芐啶天然耐藥，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株檢出率為83.7%,與袁少偉報(bào)道的85.71%較接近[15]。兒科常見(jiàn)分離菌株雖對(duì)氯霉素、氟喹諾酮類、四環(huán)素敏感性高，但由于有較大的毒性以及影響骨骼生長(zhǎng)，兒童不宜應(yīng)用。

葡萄球菌屬未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達(dá)福普汀、替加環(huán)素菌株，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢出率為25.6%，和四川省2015年檢出率23.2%較接近[5]，高于王群報(bào)道的17.65%[16],低于黃蓮芬報(bào)道的29.98%[17]以及2016年全國(guó)平均水平(38.4%)[8]，MRSA特有的mecA基因大量表達(dá)一種青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a),PBP2a與β-內(nèi)酰胺抗生素的結(jié)合率很低，引起耐藥。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)檢出率為78.1%,和2016年全國(guó)平均水平(77.6%)[8]、四川省2015年平均水平(81.7%)[5]較接近。

腸桿菌科細(xì)菌主要來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)，以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌為主，與邸春陽(yáng)報(bào)道的較一致[18]，兩種菌株產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶 (ESBLs)分別為50和45.5%，高于四川省2015年平均水平(47.3%、39.4%)[5]和2016年全國(guó)平均水平(45.2%、25.2%)[8]，產(chǎn)ESBL菌株對(duì)頭孢菌素類、單酰胺類、青霉素類具有較高的耐藥性，但對(duì)碳青酶烯類、頭孢酶烯類有較高的敏感性，對(duì)有酶抑制劑的藥物敏感，這與革蘭陰性桿菌高產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶有關(guān)。CRE以肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌為主，未檢出大腸埃希菌CRE。應(yīng)加強(qiáng)兒童產(chǎn)ESBL、CRE細(xì)菌的流行病學(xué)監(jiān)控，增強(qiáng)治療和控制措施在兒童中的意識(shí)[19]。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物敏感，但其有較強(qiáng)的腎、耳毒性以及神經(jīng)肌肉阻斷作用，不適于兒科及新生兒科的治療用藥。

腹瀉是兒童的常見(jiàn)疾病，其主要致病菌為傷寒沙門菌，以鼠傷寒沙門菌為主[20-21],本研究的腹瀉分離致病菌主要為鼠傷寒沙門菌，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的一致[20-21]，沙門菌屬對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性較高[8]。腸球菌屬和念珠菌主要來(lái)源于尿液和血液，未檢出耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)。

本研究詳細(xì)分析了兒科住院患者的病原菌分布及藥物敏感性特點(diǎn)，并與國(guó)內(nèi)部分報(bào)道做了比較，指出兒科患者以社區(qū)獲得性感染為主，對(duì)兒科醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)用藥具有指導(dǎo)作用，也為基層微生物工作者指明了兒科細(xì)菌培養(yǎng)的工作方向，創(chuàng)新性提出了血液感染的判斷原則。

4 結(jié)論

引起兒童感染的病原體較多，以流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌感染為主，部分細(xì)菌耐藥率及多重耐藥率較高，特別應(yīng)加強(qiáng)對(duì)血液兒科、重癥兒科的ESBLs、CRE、MRSA、VRE的監(jiān)測(cè)及預(yù)防，正確合理選用抗菌藥物，減低細(xì)菌的耐藥率，控制多重耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散。